| 致谢 | 第5-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语 | 第10-11页 |
| 目次 | 第11-15页 |
| 1 引言 | 第15-19页 |
| 2 材料和方法 | 第19-54页 |
| 2.1 材料 | 第19-36页 |
| 2.1.1 抗体 | 第19-20页 |
| 2.1.2 胞系 | 第20页 |
| 2.1.3 胞培养及处理用液 | 第20-21页 |
| 2.1.4 菌株 | 第21页 |
| 2.1.5 细菌培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.6 质粒 | 第22-23页 |
| 2.1.7 克隆构建所需试剂 | 第23-26页 |
| 2.1.8 siRNA干扰相关试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.9 转染相关试剂 | 第27页 |
| 2.1.10 报告基因检测试剂 | 第27页 |
| 2.1.11 Real-time PCR实验相关试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.12 Western blot相关试剂 | 第28-31页 |
| 2.1.13 免疫荧光相关试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.14 DNA pulldown相关试剂 | 第32-34页 |
| 2.1.15 银染 | 第34页 |
| 2.1.16 免疫共沉淀相关试剂 | 第34-35页 |
| 2.1.17 染色质免疫沉淀相关试剂 | 第35-36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-54页 |
| 2.2.1 胞培养及处理 | 第36-37页 |
| 2.2.2 基因组DNA的提取 | 第37页 |
| 2.2.3 PCR | 第37-38页 |
| 2.2.4 PCR产物的清洁回收 | 第38-39页 |
| 2.2.5 DNA的凝胶回收 | 第39页 |
| 2.2.6 连接反应 | 第39-40页 |
| 2.2.7 感受态细菌的大量制备 | 第40页 |
| 2.2.8 感受态细菌的转化 | 第40-41页 |
| 2.2.9 细菌质粒DNA的制备 | 第41页 |
| 2.2.10 定点突变 | 第41-42页 |
| 2.2.11 细胞转染 | 第42-43页 |
| 2.2.12 Real-time RT-PCR | 第43-45页 |
| 2.2.13 细胞中全蛋白的提取 | 第45页 |
| 2.2.14 细胞核蛋白的提取 | 第45-46页 |
| 2.2.15 Bradford法蛋白定量 | 第46页 |
| 2.2.16 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹 | 第46-48页 |
| 2.2.17 报告基因检测 | 第48-49页 |
| 2.2.18 免疫荧光 | 第49页 |
| 2.2.19 PI-annexin V染色-流式检测细胞凋亡 | 第49-50页 |
| 2.2.20 DNA pulldown试验步骤 | 第50页 |
| 2.2.21 免疫共沉淀 | 第50-51页 |
| 2.2.22 染色质免疫沉淀 | 第51-53页 |
| 2.2.23 统计学分析 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-96页 |
| 3.1 MNNG促进RRM2、p53R2转录水平上调 | 第54-59页 |
| 3.1.1 MNNG促进RRM2、p53R2蛋白水平上调 | 第54-55页 |
| 3.1.2 MNNG促进RRM2、p53R2 mRNA水平上调 | 第55-56页 |
| 3.1.3 MNNG促进RRM2、p53R2启动子报告基因水平上调 | 第56-57页 |
| 3.1.4 翻译抑制剂CHX可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2蛋白水平上调 | 第57-58页 |
| 3.1.5 转录抑制剂ActD可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2 mRNA水平上调 | 第58-59页 |
| 3.2 MNNG引起RRM2、p53R2核转位,同时入核的RRM2、p53R2参与修复DNA损伤 | 第59-65页 |
| 3.2.1 MNNG引起RRM2、p53R2核转位 | 第59-60页 |
| 3.2.2 上调的RRM2、p53R2参与MNNG引起的DNA损伤修复过程 | 第60-62页 |
| 3.2.3 RRM2表达上调抑制MNNG引起的细胞周期阻滞 | 第62-63页 |
| 3.2.4 RRM2表达上调抑制MNNG引起的细胞凋亡 | 第63-65页 |
| 3.3 RRM2基因的转录因子筛选 | 第65-78页 |
| 3.3.1 RRM2基因的转录因子筛选策略 | 第65页 |
| 3.3.2 RRM2 promoter DNA亲和层析-银染结果 | 第65-67页 |
| 3.3.3 RRM2启动子DNA pull-down蛋白质谱鉴定结果及功能分类 | 第67-75页 |
| 3.3.4 报告基因实验筛选在MNNG处理后激活RRM2转录的蛋白因子 | 第75-77页 |
| 3.3.5 MNNG对E2F3、E2F1及NFY与外源RRM2启动子DNA结合的影响 | 第77页 |
| 3.3.6 MNNG对E2F3、E2F1及NFY与内源RRM2启动子DNA结合的影响 | 第77-78页 |
| 3.4 MNNG诱导RRM2表达升高依赖于E2F3、NFY的调控作用 | 第78-87页 |
| 3.4.1 RRM2启动子区包含有多个潜在的E2F、NFY结合位点,其中RRM2启动子-227/-110区段介导了RRM2基因对MNNG的应答效应 | 第78-79页 |
| 3.4.2 位于RRM2启动子-227/-110区段上的E2F、NFY结合位点对MNNG诱导RRM2启动子报告基因活性上调至关重要 | 第79-80页 |
| 3.4.3 NFY调控E2F3、E2F1与外源RRM2启动子DNA的结合 | 第80-81页 |
| 3.4.4 NFY调控E2F3、E2F1与内源RRM2启动子DNA的结合 | 第81-82页 |
| 3.4.5 分别敲低E2F3、E2F1、NFYB对RRM2报告基因活性的影响 | 第82-83页 |
| 3.4.6 E2F3、E2F1、NFY及p53对RRM2、p53R2基因mRNA水平的影响 | 第83-84页 |
| 3.4.7 在p53缺失细胞株H1299中,MNNG对RRM2、p53R2蛋白水平的影响 | 第84页 |
| 3.4.8 E2F1、E2F3、NFY对MNNG引起RRM2蛋白水平上调的影响 | 第84-85页 |
| 3.4.9 E2F3调控RRM2表达上调在修复MNNG引起的DNA损伤过程中起重要作用 | 第85-86页 |
| 3.4.10 E2F3参与修复MNNG引起的DNA损伤依赖于RRM2 | 第86-87页 |
| 3.5 E2F3激活RRM2上调依赖于E2F3与NFY的相互作用 | 第87-90页 |
| 3.5.1 过表达的E2F3激活RRM2报告基因活性上调,同时此激活作用依赖于NFY | 第87-88页 |
| 3.5.2 DP1、NFY及YY1与E2F3具有相互作用 | 第88-89页 |
| 3.5.3 E2F3与NFY具有相互作用 | 第89-90页 |
| 3.6 MNNG引起的RRM2表达上调依赖于ATR-CHK1-E2F3信号通路及NFY的表达上调 | 第90-96页 |
| 3.6.1 MNNG诱导E2F3表达上调不依赖于其mRNA水平 | 第90-91页 |
| 3.6.2 MNNG处理后E2F3蛋白稳定性增强 | 第91-92页 |
| 3.6.3 MNNG诱导E2F3上调依赖于上游激酶CHK1 | 第92-93页 |
| 3.6.4 MNNG激活RRM2表达上调依赖于ATR-CHK1-E2F3信号通路 | 第93-94页 |
| 3.6.5 MNNG处理后短时间内诱导NFYA、NFYB mRNA水平上调 | 第94-96页 |
| 4 讨论与展望 | 第96-102页 |
| 4.1 讨论 | 第96-101页 |
| 4.2 展望 | 第101-102页 |
| 5 结论及创新点 | 第102-103页 |
| 5.1 结论 | 第102页 |
| 5.2 创新点 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-109页 |
| 综述 | 第109-132页 |
| 参考文献 | 第122-132页 |
| 作者简历及在学期间取得的科研成果 | 第132页 |
