| 摘要 | 第5-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第15-20页 |
| 1 绪论 | 第20-45页 |
| 1.1 引言 | 第20-21页 |
| 1.2 microRNA的多重生物学功能 | 第21-23页 |
| 1.2.1 microRNA形成过程 | 第21-22页 |
| 1.2.2 microRNA的多重生物学功能 | 第22-23页 |
| 1.3 神经元轴突发育与细胞自噬 | 第23-31页 |
| 1.3.1 神经元轴突发育 | 第23-28页 |
| 1.3.1.1 神经元结构 | 第23页 |
| 1.3.1.2 神经元极性形成 | 第23-24页 |
| 1.3.1.3 轴突延伸、分支和分支稳定 | 第24-25页 |
| 1.3.1.4 轴突发育的影响因素 | 第25-28页 |
| 1.3.1.5 microRNA调控轴突发育的案例 | 第28页 |
| 1.3.2 细胞自噬 | 第28-31页 |
| 1.3.2.1 细胞自噬概念及分类 | 第28-29页 |
| 1.3.2.2 自噬过程 | 第29-30页 |
| 1.3.2.3 自噬对神经元轴突的影响 | 第30页 |
| 1.3.2.4 microRNA调控细胞自噬的案例 | 第30-31页 |
| 1.4 Srsf1参与肿瘤增殖调控以及Srsf1基因自调控 | 第31-34页 |
| 1.4.1 Srsf1参与肿瘤增殖调控 | 第31-33页 |
| 1.4.1.1 Srsf1基因的经典功能 | 第31-32页 |
| 1.4.1.2 Srsf1与肿瘤增殖 | 第32页 |
| 1.4.1.3 microRNA调控肿瘤增殖案例 | 第32-33页 |
| 1.4.2 Srsf1基因自调控 | 第33-34页 |
| 1.4.2.1 Srsf1/miRNA负反馈环调控 | 第33页 |
| 1.4.2.2 SRSF1自结合调控 | 第33-34页 |
| 1.5 miR5053p已知生物学功能 | 第34页 |
| 1.5.1 miR5053p是一种肿瘤相关基因 | 第34页 |
| 1.6 本论文的研究目标、内容和创新性 | 第34-38页 |
| 1.6.1 研究目标 | 第34-35页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第35-37页 |
| 1.6.2.1 研究内容 | 第35-36页 |
| 1.6.2.2 技术路线 | 第36页 |
| 1.6.2.3 拟解决的关键性问题 | 第36-37页 |
| 1.6.3 创新性 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-45页 |
| 2 miR5053p通过影响Atg12/细胞自噬/线粒体通路调控轴突发育 | 第45-98页 |
| 2.1 引言 | 第45页 |
| 2.2 材料与方法 | 第45-72页 |
| 2.2.1 原料试剂 | 第45-46页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第46页 |
| 2.2.3 实验方法 | 第46-72页 |
| 2.2.3.1 神经元分离及体外培养 | 第46-47页 |
| 2.2.3.2 脂质体转染及神经元形态观察 | 第47-48页 |
| 2.2.3.3 电穿孔转染及神经元形态观察 | 第48页 |
| 2.2.3.4 细胞与组织总RNA抽提 | 第48-49页 |
| 2.2.3.5 miRNA qPCR检测 | 第49-51页 |
| 2.2.3.6 轴突及各级分支定义 | 第51-52页 |
| 2.2.3.7 胚胎电转 | 第52页 |
| 2.2.3.8 灌流、取脑及脑组织样本后固定 | 第52-53页 |
| 2.2.3.9 冰冻切片 | 第53-54页 |
| 2.2.3.10 sgRNA设计 | 第54-55页 |
| 2.2.3.11 PCR分型鉴定 | 第55页 |
| 2.2.3.12 测序分型鉴定 | 第55-57页 |
| 2.2.3.13 脱靶预测 | 第57-58页 |
| 2.2.3.14 HE染色 | 第58-59页 |
| 2.2.3.15 生物信息学分析预测靶基因 | 第59-60页 |
| 2.2.3.16 巣式PCR结合一步克隆法构建靶位点荧光素酶表达载体 | 第60-62页 |
| 2.2.3.17 病毒包装及滴度检测 | 第62-65页 |
| 2.2.3.18 qPCR检测靶基因mRNA表达量 | 第65页 |
| 2.2.3.19 电转神经元过表达外源基因 | 第65-66页 |
| 2.2.3.20 ATG12 ORF过表达载体构建 | 第66-68页 |
| 2.2.3.21 电镜用小鼠神经元体外培养 | 第68页 |
| 2.2.3.22 电镜用神经元样品制备 | 第68-69页 |
| 2.2.3.23 电镜用皮层组织样品制备 | 第69页 |
| 2.2.3.24 细胞免疫荧光染色 | 第69页 |
| 2.2.3.25 电镜用成纤维细胞样品制备 | 第69-70页 |
| 2.2.3.26 RPMC及CQ给药方案 | 第70页 |
| 2.2.3.27 拍图及数据处理 | 第70-72页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第72-90页 |
| 2.3.1 miR-505 与神经系统发育的潜在联系 | 第72页 |
| 2.3.2 miR-505 前体和成熟体在大脑皮层中的表达 | 第72-73页 |
| 2.3.3 miR5053p促进神经元轴突分支 | 第73-74页 |
| 2.3.4 miR5053p促进神经元极性建立和轴突生长 | 第74页 |
| 2.3.5 miR5053p不影响其他神经突起发育 | 第74-75页 |
| 2.3.6 抑制miR5053p干扰轴突发育 | 第75-76页 |
| 2.3.7 miR5053p在P3时促进对侧皮层神经元轴突生长 | 第76页 |
| 2.3.8 miR5053p在P8时促进同侧和对侧皮层神经元轴突分支 | 第76-77页 |
| 2.3.9 miR5053p敲除阻碍轴突发育 | 第77-78页 |
| 2.3.10 miR5053p敲除不影响神经元增殖 | 第78-79页 |
| 2.3.11 Atg12在各候选靶基因中 3’UTR受miR5053p抑制最显著 | 第79页 |
| 2.3.12 Atg12在各候选靶基因中mRNA受miR5053p抑制最显著 | 第79-80页 |
| 2.3.13 Atg123’UTR受miR5053p特异性抑制 | 第80-81页 |
| 2.3.14 ATG12蛋白表达受miR5053p显著抑制 | 第81页 |
| 2.3.15 ATG12抑制体外培养神经元极性建立、轴突生长及分支 | 第81-82页 |
| 2.3.16 ATG12抑制体内皮层神经元轴突生长及分支 | 第82-84页 |
| 2.3.17 ATG12不影响其他神经突起发育 | 第84页 |
| 2.3.18 miR5053p敲除引起神经元自噬激活 | 第84-86页 |
| 2.3.19 miR5053p敲除引起神经元线粒体减少 | 第86页 |
| 2.3.20 miR5053p敲除引起自噬通路关键蛋白表达量改变 | 第86-87页 |
| 2.3.21 过表达ATG12类似RPMC上游激活自噬通路 | 第87-88页 |
| 2.3.22 miR5053p调控Atg12抑制自噬小体数目和面积 | 第88页 |
| 2.3.23 miR5053p调控Atg12促进线粒体数目增加但不影响面积 | 第88-89页 |
| 2.3.24 miR5053p调控Atg12影响自噬通路相关蛋白表达 | 第89-90页 |
| 2.3.25 miR5053p调控Atg12影响ATG12聚集体和自噬小体形成 | 第90页 |
| 2.4 本章小结 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-98页 |
| 3 miR5053p通过SRSF1调控肿瘤细胞系增殖受SRSF1自调控影响 | 第98-124页 |
| 3.1 引言 | 第98页 |
| 3.2 材料与方法 | 第98-105页 |
| 3.2.1 原料试剂 | 第98-99页 |
| 3.2.2 仪器设备 | 第99页 |
| 3.2.3 实验方法 | 第99-105页 |
| 3.2.3.1 肿瘤细胞系培养 | 第99-100页 |
| 3.2.3.2 质粒载体构建、miRNA模拟物及抑制物合成 | 第100页 |
| 3.2.3.3 质粒抽提 | 第100-101页 |
| 3.2.3.4 双荧光素酶活性检测 | 第101页 |
| 3.2.3.5 WB检测靶基因蛋白表达量 | 第101-102页 |
| 3.2.3.6 SRSF1 ORF过表达载体构建 | 第102-104页 |
| 3.2.3.7 MEF细胞原代培养 | 第104-105页 |
| 3.2.3.8 ki67阳性细胞统计方法 | 第105页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第105-117页 |
| 3.3.1 Srsf13'UTR上3个潜在靶位点中存在唯一真实靶位点 | 第105-107页 |
| 3.3.2 靶位点在进化上极端保守 | 第107-108页 |
| 3.3.3 miR5053p减血清条件下能抑制肿瘤细胞系增殖 | 第108-110页 |
| 3.3.4 miR5053p全血清条件下不能抑制肿瘤细胞系增殖 | 第110-111页 |
| 3.3.5 SRSF1蛋白表达量以及ki67表达量与血清浓度呈正比 | 第111-112页 |
| 3.3.6 过表达外源SRSF1蛋白阻断miR5053p对于Srsf1的抑制 | 第112-113页 |
| 3.3.7 生信预测靶位点附近存在SRSF1蛋白自调控结合位点 | 第113-114页 |
| 3.3.8 荧光素酶鉴定SRSF1蛋白自调控结合位点 | 第114-115页 |
| 3.3.9 SRSF1通过蛋白-mRNA自调控结合干扰miRNA-mRNA结合 | 第115页 |
| 3.3.10 肿瘤微环境与基因互作的复杂性 | 第115页 |
| 3.3.11 miR5053p通过SRSF1影响其他生理功能 | 第115-117页 |
| 3.4 本章小结 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-124页 |
| 4 总结与展望 | 第124-128页 |
| 附录I 攻读学位期间所发表的学术论文情况及基金支持 | 第128-129页 |
| 附录II 致谢 | 第129-130页 |
