| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 常用缩写词 | 第7-15页 |
| 1 前言 | 第15-26页 |
| 1.1 干扰素研究进展 | 第15-22页 |
| 1.1.1 干扰素的来源及其分类 | 第15-16页 |
| 1.1.2 干扰素的分子结构 | 第16页 |
| 1.1.3 干扰素的作用机理 | 第16-17页 |
| 1.1.4 干扰素生物学活性 | 第17-19页 |
| 1.1.4.1 抗病毒活性 | 第17-18页 |
| 1.1.4.2 抗肿瘤活性 | 第18页 |
| 1.1.4.3 免疫调节活性 | 第18-19页 |
| 1.1.4.4 其他活性 | 第19页 |
| 1.1.5 基因工程重组干扰素的研究及应用 | 第19-22页 |
| 1.1.5.1 基因工程重组干扰素在兽医临床上的研究及应用 | 第20-21页 |
| 1.1.5.2 鸭基因工程重组干扰素的研究及应用 | 第21-22页 |
| 1.2 白细胞介素18研究进展 | 第22-24页 |
| 1.2.1 白细胞介素18的分子结构 | 第22-23页 |
| 1.2.2 白细胞介素18的生物学活性与应用 | 第23-24页 |
| 1.2.2.1 白细胞介素18的免疫增强作用与应用 | 第23-24页 |
| 1.2.2.2 白细胞介素18的抗病毒作用与应用 | 第24页 |
| 1.2.2.3 白细胞介素18的抗肿瘤作用与应用 | 第24页 |
| 1.3 重叠延伸PCR技术概况 | 第24-25页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-46页 |
| 2.1 材料 | 第26-29页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第26页 |
| 2.1.2 鸭胚、动物和病毒株 | 第26页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4 主要溶液的配置 | 第27-28页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.2 方法 | 第29-46页 |
| 2.2.1 鸭IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18表达载体的构建 | 第29-36页 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 | 第29页 |
| 2.2.1.2 鸭外周血淋巴细胞RNA的提取 | 第29-31页 |
| 2.2.1.3 鸭IFN-α、IFN-γ 和IL-18 基因的PCR扩增及纯化回收 | 第31页 |
| 2.2.1.4 鸭IFN-α、IFN-γ 和IL-18 基因与p MD19-T载体的连接与转化 | 第31-32页 |
| 2.2.1.5 鸭IFN-α、IFN-γ 和IL-18 重组质粒的鉴定及提取 | 第32-33页 |
| 2.2.1.6 鸭IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18融合基因的PCR扩增及纯化回收 | 第33-34页 |
| 2.2.1.7 鸭IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18融合基因与p MD19-T载体的连接与转化 | 第34页 |
| 2.2.1.8 鸭IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18重组质粒的鉴定及提取 | 第34-35页 |
| 2.2.1.9 重组表达载体p ET-32a-Du IFN-α、p ET-32a-Du IFN-γ、p ET-32a-Du IL-18、p ET-32a-Du IFNα-Du IFNγ 和p ET-32a-Du IFNα-Du IL18的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.1.9.1 重组质粒与p ET32a(+)载体的酶切及目的片段的回收 | 第35页 |
| 2.2.1.9.2 目的基因与重组表达载体的连接与转化 | 第35-36页 |
| 2.2.1.9.3 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.2.1.9.4 重组表达质粒的序列测定及提取 | 第36页 |
| 2.2.2 鸭IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18基因的原核表达与纯化 | 第36-39页 |
| 2.2.2.1 重组表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.2.2.2 重组蛋白SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| 2.2.2.3 重组蛋白免疫印记分析 | 第38页 |
| 2.2.2.4 重组蛋白表达条件优化 | 第38页 |
| 2.2.2.5 重组蛋白的可溶性分析 | 第38-39页 |
| 2.2.2.6 重组蛋白的纯化及浓度测定 | 第39页 |
| 2.2.3 鸭重组细胞蛋白体外抗病毒活性检测 | 第39-41页 |
| 2.2.3.1 鸭胚成纤维细胞（DEF）的制作 | 第39-40页 |
| 2.2.3.2 水泡型口炎病毒（VSV）在鸭胚成纤维细胞上的增殖及TCID50测定 | 第40页 |
| 2.2.3.3 禽流感病毒（AIV）和鸭瘟病毒（DPV）在鸭胚上的增殖及TCID50测定 | 第40页 |
| 2.2.3.4 重组蛋白对VSV抑制作用研究 | 第40-41页 |
| 2.2.3.5 重组蛋白对AIV和DPV的抑制作用研究 | 第41页 |
| 2.2.4 鸭重组蛋白体内抗AIV和DPV作用研究 | 第41-45页 |
| 2.2.4.1 鸭重组蛋白体内抗AIV实验分组与设计 | 第41-42页 |
| 2.2.4.2 实验鸭喉和泄殖腔AIV排毒量检测 | 第42页 |
| 2.2.4.3 鸭脑、肺和脾AIV含量检测 | 第42页 |
| 2.2.4.4 鸭重组蛋白体内抗DPV作用实验分组与设计 | 第42-43页 |
| 2.2.4.5 绝对定量PCR检测DPV方法的建立 | 第43-45页 |
| 2.2.4.5.1 鸭瘟病毒UL30基因引物的设计与合成 | 第43页 |
| 2.2.4.5.2 鸭瘟病毒UL30基因的PCR扩增及重组质粒标准品的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.4.5.3 荧光定量PCR的扩增及标准曲线的制备 | 第44页 |
| 2.2.4.5.4 荧光定量PCR敏感性和重复性实验 | 第44-45页 |
| 2.2.4.6 荧光定量PCR检测鸭脑和十二指肠中DPV含量 | 第45页 |
| 2.2.5 重组鸭IFN-α、IL-18 和IFNα-IL18对禽流感H5N1灭活疫苗免疫调节作用的研究 | 第45-46页 |
| 2.2.5.1 禽流感H5N1灭活疫苗的制备 | 第45页 |
| 2.2.5.2 AIV免疫实验分组与设计 | 第45-46页 |
| 2.2.5.3 血凝抑制实验检测AIV抗体水平 | 第46页 |
| 2.2.5.4 实验鸭喉和泄殖腔AIV排毒量检测 | 第46页 |
| 2.2.5.5 实验鸭脑、肺和脾AIV含量检测 | 第46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-73页 |
| 3.1 鸭IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18表达载体的构建结果 | 第46-51页 |
| 3.1.1 鸭IFN-α、IFN-γ 和IL-18 的PCR扩增结果 | 第46-47页 |
| 3.1.2 鸭IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18基因扩增结果 | 第47-48页 |
| 3.1.3 重组细胞因子基因的菌液PCR鉴定 | 第48页 |
| 3.1.4 重组质粒的序列测定与分析 | 第48-49页 |
| 3.1.5 重组表达质粒的双酶切鉴定 | 第49-51页 |
| 3.1.6 重组表达质粒的序列测定与分析 | 第51页 |
| 3.2 鸭IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ 和IFNα-IL18基因的原核表达与纯化 | 第51-56页 |
| 3.2.1 重组蛋白SDS-PAGE及Western blot分析结果 | 第51-53页 |
| 3.2.2 重组蛋白表达条件的优化结果 | 第53-55页 |
| 3.2.3 重组蛋白的可溶性分析 | 第55页 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化及浓度测定 | 第55-56页 |
| 3.3 鸭重组蛋白体外抗病毒活性检测 | 第56-60页 |
| 3.3.1 VSV、AIV和DPV病毒滴度（TCID50）的测定结果 | 第56页 |
| 3.3.2 重组蛋白抗VSV活性检测结果 | 第56-57页 |
| 3.3.3 重组蛋白抗AIV活性检测结果 | 第57-59页 |
| 3.3.4 重组蛋白抗DPV活性检测结果 | 第59-60页 |
| 3.3.5 重组蛋白体外抗病毒活性结果比较 | 第60页 |
| 3.4 鸭重组蛋白体内抗病毒作用研究 | 第60-68页 |
| 3.4.1 鸭重组蛋白体内抗AIV作用实验结果 | 第60-65页 |
| 3.4.1.1 重组蛋白治疗后AIV感染鸭的存活情况 | 第60-61页 |
| 3.4.1.2 实验鸭喉和泄殖腔排毒量检测结果 | 第61页 |
| 3.4.1.3 实验鸭脑、肺和脾病毒含量检测结果 | 第61-65页 |
| 3.4.2 鸭重组蛋白体内抗DPV作用实验结果 | 第65-68页 |
| 3.4.2.1 重组蛋白治疗后DPV感染鸭的存活情况 | 第65页 |
| 3.4.2.2 绝对定量PCR检测DPV方法的建立 | 第65-67页 |
| 3.4.2.2.1 鸭瘟病毒UL30基因的PCR扩增及克隆结果 | 第65-66页 |
| 3.4.2.2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第66-67页 |
| 3.4.2.2.3 荧光定量PCR敏感性和重复性检测 | 第67页 |
| 3.4.2.3 实验鸭脑和十二指肠病毒含量检测结果 | 第67-68页 |
| 3.4.3 重组蛋白体内抗病毒实验结果比较分析 | 第68页 |
| 3.5 重组鸭IFN-α、IL-18 和IFNα-IL18对禽流感H5N1灭活疫苗免疫调节作用实验结果 | 第68-71页 |
| 3.5.1 抗体水平检测结果 | 第68页 |
| 3.5.2 免疫鸭攻毒保护率 | 第68-69页 |
| 3.5.3 实验鸭喉和泄殖腔排毒量检测结果 | 第69页 |
| 3.5.4 实验鸭脑、肺和脾病毒含量检测结果 | 第69-70页 |
| 3.5.5 重组蛋白免疫增强作用实验结果比较分析 | 第70-71页 |
| 附表 | 第71-73页 |
| 4 讨论 | 第73-76页 |
| 4.1 关于重组蛋白的表达及包涵体纯化 | 第73页 |
| 4.2 关于重组蛋白生物学活性的测定 | 第73-75页 |
| 4.3 关于重组蛋白的应用 | 第75-76页 |
| 全文总结 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-85页 |
| 附录：攻读硕士学位期间发表文章 | 第85页 |
