| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 英文缩略词及英汉对照 | 第6-11页 |
| 1 前言 | 第11-22页 |
| 1.1 蛋白质（酶）固定化技术研究概述 | 第11-16页 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统研究 | 第16-17页 |
| 1.3 相关蛋白简介 | 第17-20页 |
| 1.4 本研究的主要目的和主要内容 | 第20-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-26页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 主要引物 | 第22-23页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第23页 |
| 2.1.4 试剂及试剂盒 | 第23页 |
| 2.1.5 主要试剂配制 | 第23-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-40页 |
| 2.2.1 载体构建 | 第26-30页 |
| 2.2.1.1 目的片段的扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.2.1.3 目的片段的回收 | 第27-28页 |
| 2.2.1.4 质粒的抽提 | 第28页 |
| 2.2.1.5 DNA酶切连接 | 第28-30页 |
| 2.2.2 大肠杆菌的热击转化 | 第30-31页 |
| 2.2.2.1 大肠杆菌热击感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.2.2 热击转化感受态细胞 | 第31页 |
| 2.2.2.3 重组子筛选、鉴定和保存 | 第31页 |
| 2.2.3 融合蛋白胞内表达 | 第31-32页 |
| 2.2.4 TEV蛋白酶体外酶切反应 | 第32页 |
| 2.2.5 目的蛋白的修饰 | 第32-34页 |
| 2.2.5.1 样品前处理 | 第32页 |
| 2.2.5.2 3,4-二溴马来酰亚胺可逆修饰 | 第32-33页 |
| 2.2.5.3 透析交换盐离子 | 第33页 |
| 2.2.5.4 超滤浓缩样品 | 第33页 |
| 2.2.5.5 CoA修饰 | 第33-34页 |
| 2.2.6 Ni-NTA柱纯化目的蛋白 | 第34页 |
| 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第34-36页 |
| 2.2.8 蛋白浓度的测定 | 第36页 |
| 2.2.9 目的蛋白的固定化 | 第36-37页 |
| 2.2.10 固定化蛋白活性分析 | 第37-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-67页 |
| 3.1 载体的构建 | 第40-47页 |
| 3.1.1 pET28b-X-His与pET28b-ACP-X-His系列载体的构建 | 第40-43页 |
| 3.1.2 pET28b-ACP-RS-G2-X-His系列载体的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.3 TEV蛋白酶基因相关载体的构建 | 第44-47页 |
| 3.1.3.1 pET28b-MBP-TEV表达载体的构建 | 第44-46页 |
| 3.1.3.2 pSU18-MBP-TEV表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.1.4 相关载体说明 | 第47页 |
| 3.2 目的蛋白在大肠杆菌中的表达、修饰与纯化 | 第47-55页 |
| 3.2.1 ACP对目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的影响 | 第47-49页 |
| 3.2.2 GFP纯化 | 第49-50页 |
| 3.2.3 ACP融合蛋白的TEV酶切分析与目的蛋白纯化 | 第50-53页 |
| 3.2.3.1 ACP融合蛋白的TEV体外酶切分析与目的蛋白纯化 | 第50-52页 |
| 3.2.3.2 ACP融合蛋白的TEV体内酶切分析与目的蛋白纯化 | 第52-53页 |
| 3.2.4 GFP-His与ACP-X-His蛋白修饰与纯化 | 第53-55页 |
| 3.3 蛋白酶的固定化研究 | 第55-61页 |
| 3.3.1 GFP固定化条件探究 | 第55-57页 |
| 3.3.2 holo-ACP介导的蛋白固定化研究 | 第57-61页 |
| 3.3.2.1 holo-ACP介导的GFP蛋白固定化研究 | 第57-59页 |
| 3.3.2.2 holo-ACP介导的蛋白固定化动态过程分析 | 第59-61页 |
| 3.4 固定化重组蛋白活性分析 | 第61-67页 |
| 3.4.1 GFP荧光强度分析 | 第61页 |
| 3.4.2 GlcK蛋白酶活性初步测定 | 第61-64页 |
| 3.4.3 Amy蛋白酶活性初步测定 | 第64-67页 |
| 4 讨论 | 第67-70页 |
| 4.1 ACP对目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的影响 | 第67页 |
| 4.2 建立融合表达的目的蛋白的简便纯化体系 | 第67-68页 |
| 4.3 建立holo-ACP介导的蛋白质（酶）定向、共价固定化体系 | 第68-70页 |
| 5 结论 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-80页 |
| 附录 | 第80页 |
