| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第9-18页 |
| 1.1 氟化酶概述 | 第9-12页 |
| 1.1.1 氟化天然产物简介 | 第9页 |
| 1.1.2 氟化酶的发现 | 第9-10页 |
| 1.1.3 Streptomyces cattleya中氟化天然产物的合成通路 | 第10-11页 |
| 1.1.4 氟化合成通路中的关键酶 | 第11-12页 |
| 1.2 研究微生物氟化天然产物合成机制的意义 | 第12-14页 |
| 1.3 氟化酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.4 本课题的研究内容及研究意义 | 第15-18页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第15-16页 |
| 1.4.2 研究意义 | 第16-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.1.1 菌株、质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 药品与相关试剂 | 第18-20页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第20-21页 |
| 2.1.4 相关溶液配制 | 第21-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-40页 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| 2.2.2 重组质粒pET-28a(+)- Y77A/pET-28a(+)-T80A/pET-28a(+)-T80S/pET-28a(+)-F156A/pET-28a(+)-S158A的构建 | 第24-32页 |
| 2.2.3 重组质粒pET-28a(+)-D16E的构建 | 第32-33页 |
| 2.2.4 氟化酶蛋白的表达 | 第33-34页 |
| 2.2.5 D16E/Y77A/T80A/T80S/F156A/S158A突变体蛋白的表达 | 第34页 |
| 2.2.6 氟化酶蛋白的纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.7 D16E/Y77A/T80A/T80S/F156A/S158A突变体蛋白的纯化 | 第35页 |
| 2.2.8 透析除盐 | 第35页 |
| 2.2.9 氟化酶蛋白的浓缩和蛋白浓度测定 | 第35页 |
| 2.2.10 氟化酶活性的鉴定 | 第35-37页 |
| 2.2.11 pH、温度、金属离子对氟化酶活性的影响 | 第37-38页 |
| 2.2.12 氟化酶的动力学常数测定 | 第38-39页 |
| 2.2.13 室温下氟化酶的稳定性 | 第39页 |
| 2.2.14 氟化酶的热量迁移实验 | 第39页 |
| 2.2.15 野生型和突变体之间的二级结构定性分析 | 第39页 |
| 2.2.16 氟化酶的氯酶活性鉴定 | 第39-40页 |
| 3 结果与讨论 | 第40-68页 |
| 3.1 重组质粒的构建 | 第40-52页 |
| 3.1.1 重组质粒pET-28a(+)-mutants的构建 | 第41-50页 |
| 3.1.2 重组质粒pET-28a(+)-D16E的构建 | 第50-52页 |
| 3.2 氟化酶蛋白的表达与纯化 | 第52-55页 |
| 3.2.1 氟化酶蛋白表达条件的优化 | 第52-53页 |
| 3.2.2 氟化酶蛋白的纯化 | 第53-55页 |
| 3.3 氟化酶活性的鉴定 | 第55-57页 |
| 3.3.1 野生型氟化酶的活性鉴定 | 第55-56页 |
| 3.3.2 突变体氟化酶蛋白的活性鉴定 | 第56-57页 |
| 3.4 pH、温度以及金属离子对氟化酶活性的影响 | 第57-60页 |
| 3.4.1 pH对氟化酶活性的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.2 温度对氟化酶活性的影响 | 第58-59页 |
| 3.4.3 金属离子对氟化酶活性的影响 | 第59-60页 |
| 3.5 氟化酶的动力学实验 | 第60-62页 |
| 3.5.1 5'-FDA的标准曲线 | 第60页 |
| 3.5.2 不同SAM浓度下氟化酶的动力学曲线 | 第60-61页 |
| 3.5.3 不同KF浓度下氟化酶的动力学曲线 | 第61-62页 |
| 3.6 常温下氟化酶的稳定性 | 第62页 |
| 3.7 氟化酶蛋白的热量迁移实验 | 第62-64页 |
| 3.7.1 WT和MT以及小分子化合物复合的氟化酶的热量迁移实验 | 第62-63页 |
| 3.7.2 不同buffer下的氟化酶的热量迁移实验 | 第63-64页 |
| 3.8 野生型和突变体的二级结构定性分析 | 第64-66页 |
| 3.9 氟化酶的氯酶活性验证 | 第66-68页 |
| 4 结论 | 第68-69页 |
| 5 展望 | 第69-70页 |
| 6 参考文献 | 第70-77页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第77-78页 |
| 8 致谢 | 第78页 |
