| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-18页 |
| 第1章 文献综述 | 第18-41页 |
| ·甾类物质及甾药中间体 | 第18-25页 |
| ·甾类化合物 | 第18-19页 |
| ·甾类物质的生理功能与药用价值 | 第19-20页 |
| ·甾药中间体及其生化合成工艺 | 第20-25页 |
| ·甾药分子的全化学合成 | 第20-21页 |
| ·薯蓣皂苷元合成甾药分子 | 第21-22页 |
| ·微生物辅助制备甾药 | 第22页 |
| ·微生物法合成甾药中间体 | 第22-24页 |
| ·甾药加工行业的现状 | 第24-25页 |
| ·微生物甾类代谢分子机制 | 第25-36页 |
| ·可代谢甾类物质的微生物 | 第25页 |
| ·甾类代谢菌的生物信息学 | 第25-26页 |
| ·微生物代谢甾醇的分子机制 | 第26-35页 |
| ·甾体分子的摄取与转运 | 第27-29页 |
| ·甾核的开环反应 | 第29-32页 |
| ·开环甾核的分解代谢 | 第32-33页 |
| ·甾体化合物的支链降解代谢 | 第33-34页 |
| ·微生物分解甾类物质的调控机制 | 第34-35页 |
| ·胆固醇降解与微生物致病 | 第35页 |
| ·甾药工业微生物的代谢改造 | 第35-36页 |
| ·微生物甾药中间体发酵与制备工艺 | 第36-37页 |
| ·课题的主要研究内容 | 第37-41页 |
| ·课题背景与研究基础 | 第37-39页 |
| ·课题的研究思路与主要研究方法 | 第39-41页 |
| 第2章 胆固醇氧化酶编码基因的鉴定,酶学表征以及代谢功能的研究 | 第41-82页 |
| ·引言 | 第41-42页 |
| ·技术路线 | 第42-43页 |
| ·材料与方法 | 第43-64页 |
| ·质粒及菌株 | 第43页 |
| ·扩增引物 | 第43-44页 |
| ·仪器与设备 | 第44-45页 |
| ·实验试剂与耗材 | 第45-46页 |
| ·培养基与分枝杆菌的培养 | 第46-47页 |
| ·各种缓冲液与贮存液的配置 | 第47-49页 |
| ·分枝杆菌基因组DNA提取 | 第49-50页 |
| ·分枝杆菌全基因组测序 | 第50页 |
| ·胆固醇氧化酶编码基因choM以及NEO_5239的基因组定位 | 第50-51页 |
| ·胆固醇氧化酶的敲除与功能回补 | 第51-60页 |
| ·分枝杆菌基因敲除实验特别注意事项 | 第51-53页 |
| ·目标基因上下游同源片段的克隆,连接与转化 | 第53-56页 |
| ·筛选标记的引入与自杀质粒的构建 | 第56-57页 |
| ·分枝杆菌电转感受态的制作与使用 | 第57页 |
| ·自杀质粒的碱处理与电转化 | 第57页 |
| ·两步法-同源重组双交换的筛选与验证 | 第57-58页 |
| ·基于pMV306重组质粒的基因回补实验 | 第58-60页 |
| ·敲除菌与回补菌的生长表型差异分析 | 第60页 |
| ·胆固醇氧化酶体外酶活表征 | 第60-62页 |
| ·胆固醇氧化酶信号肽序列预测 | 第60页 |
| ·目标基因的克隆与表达载体构建 | 第60页 |
| ·胆固醇氧化酶的诱导与表达 | 第60-61页 |
| ·SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第61页 |
| ·带有组氨酸标记的蛋白纯化与Bradford法蛋白定量 | 第61-62页 |
| ·酶的活性表征 | 第62页 |
| ·胆固醇氧化酶的细胞定位 | 第62-63页 |
| ·胆固醇氧化酶的过表达 | 第63页 |
| ·甾体化合物的检测与定量 | 第63-64页 |
| ·结果与讨论 | 第64-80页 |
| ·多株分枝杆菌代谢甾醇实例分析 | 第64-66页 |
| ·胆固醇氧化酶为甾醇降解关键限速酶 | 第66-67页 |
| ·分枝杆菌胆固醇氧化酶的编码基因 | 第67-70页 |
| ·编码基因的同源性分析 | 第67-68页 |
| ·ChO编码基因的序列特征分析 | 第68-70页 |
| ·choM2的基因组分布 | 第70页 |
| ·胆固醇氧化酶的基因缺失与回补 | 第70-75页 |
| ·敲除同源臂的连接与确认 | 第70-71页 |
| ·打靶质粒所携带筛选标记的验证 | 第71页 |
| ·单交换与双交换重组子的筛选 | 第71-72页 |
| ·功能回补菌株的构建 | 第72页 |
| ·ChoM影响甾醇摄取 | 第72-73页 |
| ·ChoM影响底物转化 | 第73-74页 |
| ·NEO_5239编码的3β-HSD不参与甾醇摄取与转化 | 第74-75页 |
| ·胆固醇氧化酶的细胞定位与功能机制 | 第75-76页 |
| ·体外表达ChO的催化特性与酶学表征 | 第76-78页 |
| ·ChO的表达与纯化 | 第77页 |
| ·ChO的酶学表征 | 第77-78页 |
| ·ChO活力强化与高产AD(D)工程菌株的改造 | 第78-80页 |
| ·ChO的过表达与高产菌株的构建 | 第78-79页 |
| ·高产AD(D)菌株的转化能力评估 | 第79-80页 |
| ·本章小结 | 第80-82页 |
| 第3章 3-甾酮-△~1-脱氢酶的酶学表征以及代谢功能解析 | 第82-111页 |
| ·引言 | 第82-83页 |
| ·技术路线 | 第83-84页 |
| ·材料与方法 | 第84-97页 |
| ·菌株 | 第84页 |
| ·质粒以及扩增引物 | 第84-85页 |
| ·仪器与设备 | 第85页 |
| ·实验试剂与耗材 | 第85-86页 |
| ·培养基 | 第86页 |
| ·缓冲液与贮存液 | 第86页 |
| ·KstD编码基因的鉴定与进化树的构建 | 第86-87页 |
| ·分枝杆菌MN-KstD的酶学表征 | 第87-91页 |
| ·MN-KstD信号肽以及跨膜区域的预测 | 第87-88页 |
| ·MN-KstD异源表达体系的构建 | 第88-90页 |
| ·异源表达条件的优化与粗酶液的制备 | 第90页 |
| ·MN-KstD粗酶液酶活的测定 | 第90-91页 |
| ·分枝杆菌MN-KstD转录水平的研究 | 第91-96页 |
| ·分枝杆菌总RNA的提取 | 第91-92页 |
| ·RNA样本的去DNA处理 | 第92-93页 |
| ·RNA甲醛变性电泳 | 第93-94页 |
| ·cDNA模板的合成 | 第94页 |
| ·Real-Time PCR分析不同MN-KstD酶的转录水平 | 第94-96页 |
| ·MN-KstD同工酶的代谢功能鉴定 | 第96-97页 |
| ·MN-kstD的基因敲除与功能回补 | 第96-97页 |
| ·敲除菌的表型鉴定与分析 | 第97页 |
| ·敲除菌中其它MN-kstD的转录分析 | 第97页 |
| ·甾体转化与分析 | 第97页 |
| ·结果与讨论 | 第97-110页 |
| ·分枝杆菌KstD的编码序列与MN-kstD分布特征分析 | 第97-100页 |
| ·各MN-KstD氨基酸序列同源性比对 | 第98页 |
| ·种属间3-甾酮-△~1-脱氢酶进化分析 | 第98-99页 |
| ·各MN-kstD基因组内分布特征 | 第99-100页 |
| ·MN-KstD酶活与动力学表征 | 第100-104页 |
| ·MN-KstD的分枝杆菌细胞定位 | 第100-102页 |
| ·MN-KstD异源表达体系的构建 | 第102页 |
| ·大肠杆菌MN-KstD粗酶液的制备 | 第102-103页 |
| ·粗酶液中KstD酶活分析与动力学表征 | 第103-104页 |
| ·分枝杆菌MN-KstD的底物诱导分析 | 第104-107页 |
| ·不同方法抽提分枝杆菌总RNA的比较 | 第104-105页 |
| ·消化总RNA中的基因组DNA污染 | 第105页 |
| ·MN-同工酶基因转录水平分析 | 第105-107页 |
| ·各MN-KstD酶甾体代谢功能鉴定 | 第107-109页 |
| ·MN-KstD敲除工具的构建与重组子筛选 | 第107页 |
| ·敲除菌生长与转化表型差异分析 | 第107-108页 |
| ·各敲除菌中MN-KstD转录量测定 | 第108-109页 |
| ·KstD敲除菌产9-OHAD的应用 | 第109-110页 |
| ·本章小结 | 第110-111页 |
| 第4章 3-甾酮-9α-羟基化酶的分子改造以及甾醇代谢中的应用 | 第111-146页 |
| ·引言 | 第111-112页 |
| ·技术路线 | 第112-113页 |
| ·材料与方法 | 第113-125页 |
| ·菌株 | 第113页 |
| ·质粒与引物 | 第113-114页 |
| ·仪器与设备 | 第114页 |
| ·实验试剂与耗材 | 第114-115页 |
| ·培养基 | 第115页 |
| ·缓冲液与贮存液 | 第115页 |
| ·探究双组份酶KSH的编码信息 | 第115-117页 |
| ·还原酶组分MN-KshA的编码基因 | 第115页 |
| ·加氧酶组分MN-KshB的编码基因 | 第115-116页 |
| ·KshA系统发育树的构建 | 第116-117页 |
| ·KSH加氧酶组分的代谢功能分析 | 第117-118页 |
| ·分枝杆菌MN-kshA的转录 | 第117页 |
| ·MN-kshA的基因敲除与回补 | 第117-118页 |
| ·敲除菌表型的差异分析 | 第118页 |
| ·分枝杆菌KSH酶活性表征 | 第118-121页 |
| ·MN-KshA和MN-KshB信号肽以及跨膜区域的预测 | 第118页 |
| ·构建KSH异源表达体系 | 第118-120页 |
| ·KSH酶的不同纯化方式 | 第120页 |
| ·KSH酶活性的测定与性质表征 | 第120-121页 |
| ·分枝杆菌MN-KshA的分子改造 | 第121-123页 |
| ·MN-KshA的同源建模 | 第121页 |
| ·无缝克隆技术的运用 | 第121-122页 |
| ·换活性中心构建嵌合体MN-KshA | 第122页 |
| ·构建MN-KshA1的单点突变 | 第122-123页 |
| ·构建高纯度生产9-OHAD的微生物媒介 | 第123-124页 |
| ·MN-KshA1_(V202T)的过表达 | 第123页 |
| ·转录差异分析 | 第123-124页 |
| ·蛋白差异分析 | 第124页 |
| ·甾体化合物的检测与定量 | 第124-125页 |
| ·结果与讨论 | 第125-144页 |
| ·KSH酶的序列分析 | 第125-127页 |
| ·还原酶MN-KshB | 第125页 |
| ·加氧酶MN-KshA | 第125-127页 |
| ·MN-kshA1的基因分布 | 第127页 |
| ·MN-KshA代谢功能的解析 | 第127-133页 |
| ·不同MN-kshA转录水平的比较 | 第128页 |
| ·MN-KshA敲除与回补菌的构建 | 第128-129页 |
| ·敲除菌代谢产物的差异分析 | 第129-132页 |
| ·敲除菌生长差异分析 | 第132-133页 |
| ·分枝杆菌KSH酶活性表征 | 第133-136页 |
| ·MN-KshA与MN-KshB酶的细胞分布 | 第133页 |
| ·异源表达体系的构建 | 第133页 |
| ·KSH酶组分的分别纯化与共纯化 | 第133-134页 |
| ·KSH酶底物谱的测定与酶学表征 | 第134-136页 |
| ·分子改造筛选高活性MN-KhA | 第136-139页 |
| ·MN-KshA同源建模分析 | 第136-138页 |
| ·嵌合体酶的构建与活力表征 | 第138页 |
| ·MN-KshA点突变体的筛选与鉴定 | 第138-139页 |
| ·9-OHAD高纯度积累菌株的构建 | 第139-144页 |
| ·分枝杆菌KSH酶活力的强化 | 第139-141页 |
| ·9-OHAD发酵放大评估 | 第141-142页 |
| ·NwIB-V的9-OHAD生成解析 | 第142-144页 |
| ·各9-OHAD生产菌的产能比照 | 第144页 |
| ·本章小结 | 第144-146页 |
| 第5章 基于多基因敲除的分枝杆菌侧链降解机制的初探 | 第146-164页 |
| ·引言 | 第146-148页 |
| ·技术路线 | 第148页 |
| ·材料与方法 | 第148-150页 |
| ·菌株 | 第148-149页 |
| ·质粒以及扩增引物 | 第149-150页 |
| ·其他材料与设备 | 第150页 |
| ·新金分枝杆菌甾醇降解基因簇的推定 | 第150页 |
| ·基因敲除对象的筛选 | 第150页 |
| ·侧链代谢关键基因的强化 | 第150页 |
| ·甾体化合物的鉴定 | 第150页 |
| ·结果与讨论 | 第150-162页 |
| ·侧链代谢基因的无义缺失 | 第150-156页 |
| ·KstR2及其转录调控区域 | 第150-151页 |
| ·酰基CoA硫解酶——Ltp3-4 | 第151-153页 |
| ·烯酰辅酶A水合酶—Hsd4B | 第153-154页 |
| ·酰基辅酶A转移酶——FadD19以及水合酶-EchA19 | 第154-155页 |
| ·酰基辅酶A脱氢酶——FadE26-27 | 第155-156页 |
| ·侧链代谢基因的有义缺失 | 第156-160页 |
| ·酰基辅酶A硫解酶——FadA5 | 第156-158页 |
| ·羟酰辅酶A脱氢酶——Hsd4A | 第158-159页 |
| ·微生物甾醇侧链代谢关键因子——igr操纵子及Ltp2 | 第159-160页 |
| ·值得关注的其他基因缺陷型 | 第160-161页 |
| ·构建△kshA△fadA5△ltp3-4 | 第160-161页 |
| ·构建△kshA△igr△fadA5 | 第161页 |
| ·侧链代谢关键基因的强化 | 第161-162页 |
| ·本章小结 | 第162-164页 |
| 第6章 总结与展望 | 第164-169页 |
| ·课题最新进展 | 第164-165页 |
| ·研究总结 | 第165-166页 |
| ·课题展望 | 第166-169页 |
| 参考文献 | 第169-188页 |
| 致谢 | 第188-189页 |
| 博士期间发表论文、专利及课题相关成绩 | 第189-190页 |
| 附录一 | 第190-191页 |
| 附录二 | 第191页 |
