| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第1章 前言 | 第12-34页 |
| ·代谢工程 | 第12-15页 |
| ·不同"组学"技术的组合在代谢工程中的应用 | 第13页 |
| ·系统生物学在代谢工程中的应用 | 第13-14页 |
| ·全局转录调控在代谢工程中的应用 | 第14-15页 |
| ·启动子文库 | 第15-20页 |
| ·调控基因不同强度表达的传统策略 | 第15-16页 |
| ·启动子文库可对基因表达进行精确微调 | 第16-17页 |
| ·启动子文库构建方法 | 第17-18页 |
| ·启动子文库正在成为代谢工程研究新的有力工具 | 第18-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第20-24页 |
| ·毕赤酵母表达系统特点 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统与其他表达系统比较 | 第21页 |
| ·毕赤酵母表达系统中常用启动子 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母表达系统的应用 | 第22-24页 |
| ·S-腺苷甲硫氨酸 | 第24-32页 |
| ·SAM的结构 | 第25页 |
| ·SAM的合成与降解 | 第25-27页 |
| ·SAM的生物功能 | 第27-28页 |
| ·SAM的医学应用价值 | 第28-29页 |
| ·基因工程技术在生产SAM中的应用 | 第29-31页 |
| ·外源L-Met添加和胞内ATP浓度对SAM合成和细胞代谢的影响 | 第31-32页 |
| ·课题意义与内容 | 第32-34页 |
| 第2章 材料与方法 | 第34-49页 |
| ·材料部分 | 第34-42页 |
| ·菌种和质粒 | 第34-37页 |
| ·实验试剂 | 第37-38页 |
| ·实验仪器 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第39-41页 |
| ·溶液 | 第41页 |
| ·发酵罐 | 第41-42页 |
| ·方法部分 | 第42-49页 |
| ·分子生物学方法 | 第42-44页 |
| ·检测方法 | 第44-47页 |
| ·重组菌的培养和发酵 | 第47-49页 |
| 第3章 建立高通量方法筛选突变GAP启动子 | 第49-64页 |
| ·报告基因(绿色荧光蛋白yEGFP)在毕赤酵母中的表达 | 第50-56页 |
| ·表达载体pGHg和对照质粒pGH的构建 | 第50-53页 |
| ·重组菌G/GHg和G/GH的构建 | 第53-54页 |
| ·重组菌G/GHg表达yEGFP的检测 | 第54-56页 |
| ·组成型启动子文库高通量筛选方法的建立 | 第56-62页 |
| ·筛选培养基的优化 | 第56-58页 |
| ·筛选条件的优化 | 第58-61页 |
| ·筛选方法的确立 | 第61-62页 |
| ·高通量筛选方法的验证 | 第62-63页 |
| ·小结 | 第63-64页 |
| 第4章 GAP启动子文库特性表征及应用 | 第64-82页 |
| ·GAP启动子的突变 | 第64-67页 |
| ·易错PCR条件的优化 | 第66-67页 |
| ·突变GAP启动子重组细胞库的构建 | 第67页 |
| ·GAP启动子文库的筛选 | 第67-68页 |
| ·GAP启动子文库的特性考察 | 第68-77页 |
| ·GAP启动子文库突变启动子序列分析 | 第68-70页 |
| ·重组菌yEGFP表达水平均一性检验 | 第70页 |
| ·重组菌中yEGFP的mRNA转录水平考察 | 第70-71页 |
| ·利用第二和第三报告基因对启动子文库进行验证 | 第71-77页 |
| ·利用启动子文库研究MAT酶活水平对SAM合成的影响 | 第77-81页 |
| ·小结 | 第81-82页 |
| 第5章 应用GAP启动子文库弱化SAM分解代谢途径 | 第82-106页 |
| ·CBS启动子替换载体的构建 | 第83-88页 |
| ·载体pGAP-CBS的构建 | 第85-87页 |
| ·载体pG0-CBS,pG6-CBS和pG12-CBS的构建 | 第87-88页 |
| ·不同强度启动子调控CBS表达重组菌构建 | 第88-91页 |
| ·SAM分解代谢途径CBS的弱化及分析 | 第91-96页 |
| ·重组菌生理特性研究 | 第91-92页 |
| ·各重组菌中CBS酶活及对应cys4 mRNA转录水平确证 | 第92-93页 |
| ·各重组菌中L-Met消耗 | 第93-96页 |
| ·重组菌G12-CBS在5L发酵罐中的放大培养 | 第96-101页 |
| ·重组菌G12-CBS和DS16生长 | 第96-97页 |
| ·5L发酵罐中重组菌G12-CBS的SAM产量 | 第97-98页 |
| ·5L发酵罐中重组菌G12-CBS和DS16的L-Met消耗 | 第98-100页 |
| ·重组菌胞内GSH水平 | 第100-101页 |
| ·重组菌G12-CBS在15L发酵罐中的放大培养 | 第101-104页 |
| ·小结 | 第104-106页 |
| 第6章 SAM分解代谢途径阻断的初步探索 | 第106-120页 |
| ·基因敲除质粒的构建 | 第107-112页 |
| ·各敲除基因同源片段的扩增 | 第109-110页 |
| ·质粒pDspe的构建 | 第110页 |
| ·质粒pDspeZ、pDsahZ和pDmsmZ的构建 | 第110-112页 |
| ·基因敲除重组菌的构建 | 第112-113页 |
| ·基因敲除重组菌的表型研究 | 第113-116页 |
| ·重组菌株生长特性研究 | 第113-115页 |
| ·重组菌株细胞SAM产量研究 | 第115-116页 |
| ·L-Met添加量对重组菌SAM合成的影响 | 第116-118页 |
| ·L-Met添加量对重组菌G/Dsah合成SAM的影响 | 第117页 |
| ·L-Met添加量对重组菌G/Dmsm合成SAM的影响 | 第117-118页 |
| ·本章小结 | 第118-120页 |
| 第7章 结论与展望 | 第120-124页 |
| ·主要结论 | 第120-122页 |
| ·展望 | 第122-124页 |
| 参考文献 | 第124-134页 |
| 致谢 | 第134-135页 |
| 发表论文及专利 | 第135页 |
