| 一、中文摘要 | 第1-10页 |
| 二、英文摘要 | 第10-20页 |
| 三、英文缩略词表 | 第20-21页 |
| 四、论文正文 | 第21-116页 |
| 前言 | 第21-27页 |
| 第一章 BRD7基因启动子的克隆及功能研究 | 第27-55页 |
| 第一节:材料与方法 | 第27-36页 |
| 1.材料与试剂 | 第27-29页 |
| ·主要实验仪器 | 第27页 |
| ·细胞 | 第27页 |
| ·菌株和载体 | 第27-28页 |
| ·试剂 | 第28页 |
| ·抗体 | 第28页 |
| ·试剂盒 | 第28页 |
| ·引物 | 第28-29页 |
| 2.方法 | 第29-36页 |
| ·生物信息学分析 | 第29页 |
| ·BRD7基因候选启动子区的生物信息学分析 | 第29页 |
| ·BRD7基因转录起始位点的生物信息学分析 | 第29页 |
| ·BRD7基因调控区转录因子结合位点的生物信息学分析 | 第29页 |
| ·细胞培养 | 第29-30页 |
| ·细胞总RNA的抽提 | 第30页 |
| ·差异RT-PCR | 第30-31页 |
| ·调控区长片段的克隆及其荧光素酶报告载体的构建 | 第31页 |
| ·缺失突变体荧光素酶报告载体的构建 | 第31-33页 |
| ·细胞转染及荧光素酶报告基因活性分析 | 第33页 |
| ·凝胶迁移率实验(EMSA) | 第33-34页 |
| ·染色质免疫共沉淀实验 | 第34-36页 |
| 第二节:结果 | 第36-51页 |
| 1.不同细胞株中BRD7基因的mRNA表达水平不同 | 第36-37页 |
| 2.生物信息学方法分析BRD7基因调控区的结构特征 | 第37-44页 |
| ·BRD7基因启动子区的生物信息学预测结果 | 第37-38页 |
| ·BRD7基因转录起始位点的生物信息学预测结果 | 第38-42页 |
| ·BRD7基因调控区转录因子结合位点的生物信息学预测结果 | 第42-44页 |
| 3.BRD7基因长片段调控序列-711/+496具有与SV40启动子同等强度的活性 | 第44-45页 |
| 4.克隆和鉴定BRD7基因近距离启动子序列 | 第45-48页 |
| 5.凝胶迁移率实验确定BRD7基因必需启动子区的转录因子结合位点 | 第48-50页 |
| 6.染色质免疫共沉淀实验确定BRD7基因必需启动子区的转录因子结合位点 | 第50-51页 |
| 第三节:分析与讨论 | 第51-55页 |
| 第二章 BRD7启动子区顺式作用元件和反式作用因子的鉴定及功能研究 | 第55-90页 |
| 第一节:材料与方法 | 第55-63页 |
| 1.材料与试剂 | 第55-57页 |
| ·主要实验仪器 | 第55页 |
| ·细胞 | 第55页 |
| ·菌株和载体 | 第55页 |
| ·试剂 | 第55-56页 |
| ·抗体 | 第56页 |
| ·所有引物是由在线软件Primer3设计 | 第56-57页 |
| ·野生型、突变型BRD7基因启动子序列 | 第57页 |
| 2.方法 | 第57-63页 |
| ·细胞培养 | 第57页 |
| ·构建荧光素酶报告载体 | 第57-58页 |
| ·构建绿色荧光蛋白报告载体 | 第58页 |
| ·构建pCMV-HA/c-Myc、pCMV-HA/E2F6、pCMV-HA/Sp1和pRNAT-U6.1/neo/Sic-Myc表达质粒 | 第58-59页 |
| ·建立稳定表达siRNA-c-Myc的鼻咽癌细胞系 | 第59页 |
| ·细胞转染及荧光素酶报告基因活性分析 | 第59页 |
| ·绿色荧光蛋白活体表达水平检测 | 第59页 |
| ·Western blot分析 | 第59-60页 |
| ·EMSA和Supershift实验 | 第60页 |
| ·免疫共沉淀实验 | 第60-61页 |
| ·间接免疫荧光法考察c-Myc与Sp1蛋白因子的亚细胞共定位 | 第61页 |
| ·Mithramycin A处理 | 第61页 |
| ·RT-PCR实验 | 第61-62页 |
| ·实时定量PCR(Real time-PCR) | 第62-63页 |
| 第二节:结果 | 第63-86页 |
| 1.定位BRD7最小启动子片段-266/-212 | 第63-64页 |
| 2.利用绿色荧光蛋白报告载体进一步验证BRD7基因的最小启动子片段-266/-212的启动活性 | 第64-66页 |
| 3.BRD7基因的最小启动子选择性地在c-Myc表达缺失的细胞中发挥启动活性 | 第66-68页 |
| 4.转录因子Sp1、c-Myc特异性地结合于BRD7最小启动子区 | 第68-69页 |
| 5.c-Myc大幅度地下调BRD7基因启动子活性 | 第69-71页 |
| 6.c-Myc下调BRD7基因的内源性mRNA表达水平 | 第71-72页 |
| 7.建立特异性封闭内源性c-Myc表达的鼻咽癌细胞系 | 第72-73页 |
| 8.封闭内源性c-Myc的表达提高BRD7基因启动子活性 | 第73-74页 |
| 9.封闭内源性c-Myc的表达能提高BRD7基因的mRNA表达水平 | 第74-75页 |
| 10.在鼻咽癌细胞中封闭内源性c-Myc的表达上调了关键miRNA分子的表达水平 | 第75-79页 |
| 11.突变MYC-MAX/Sp1结合位点上调BRD7基因启动子的活性 | 第79-80页 |
| 12.转录因子Sp1增强BRD7基因启动子活性 | 第80页 |
| 13.光辉酶素A(Mithramycin A)抑制BRD7基因启动子活性和内源性表达 | 第80-82页 |
| 14.蛋白因子c-Myc与Sp1在鼻咽癌5-8F细胞中存在交互作用 | 第82-83页 |
| 15.转录因子E2F6对BRD7基因最小启动子活性不具有调节作用 | 第83-84页 |
| 16.BRD7基因最小启动子区E2F6结合位点仍具有活性功能 | 第84-86页 |
| 第三节:分析与讨论 | 第86-90页 |
| 第三章 DNA甲基化抑制BRD7基因的表达,去甲基化恢复其表达 | 第90-116页 |
| 第一节:材料与方法 | 第90-94页 |
| 1.材料与试剂 | 第90页 |
| ·主要实验仪器 | 第90页 |
| ·细胞 | 第90页 |
| ·菌株和载体 | 第90页 |
| ·鼻咽癌组织及正常人外周血标本 | 第90页 |
| ·试剂 | 第90页 |
| 2.方法 | 第90-94页 |
| ·BRD7基因5’上游调控区CpG岛的生物信息学分析 | 第90-91页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第91页 |
| ·基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰 | 第91-92页 |
| ·甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)引物设计及反应参数 | 第92页 |
| ·MSP-PCR产物的序列分析 | 第92页 |
| ·5-脱氧杂氮胞苷(ADC)、曲古抑菌素A(TSA)干预 | 第92-93页 |
| ·CpG甲基化酶SssI处理 | 第93-94页 |
| 第二节:结果 | 第94-111页 |
| 1.BRD7基因启动子区为一CpG岛 | 第94-95页 |
| 2.BRD7基因启动子在鼻咽癌细胞中呈部分甲基化状态,DNA甲基化抑制BRD7基因的表达 | 第95-97页 |
| 3.DNA甲基化涉及BRD7基因启动子区多个转录因子结合位点 | 第97-98页 |
| 4.DNA甲基化抑制Sp1/MYC-MAX、E2F-6结合位点与其相应转录因子的结合 | 第98-100页 |
| 5.SssI甲基转移酶使BRD7基因启动子报告载体在鼻咽癌细胞中失去启动活性 | 第100-102页 |
| ·-脱氧杂氮胞苷能逆转鼻咽癌细胞中BRD7基因启动子甲基化状态 | 第102-103页 |
| 7.不同浓度的ADC、TSA对鼻咽癌细胞中BRD7基因表达水平的影响不同 | 第103-105页 |
| ·—脱氧杂氮胞苷对鼻咽癌5-8F细胞周期和凋亡的影响 | 第105-107页 |
| ·—脱氧杂氮胞苷上调了鼻咽癌5-8F细胞中关键miRNA分子的表达水平 | 第107-110页 |
| 10.鼻咽癌病人BRD7基因启动子甲基化频率高于正常人群 | 第110-111页 |
| 第三节:分析与讨论 | 第111-116页 |
| 五、结论 | 第116-117页 |
| 六、参考文献 | 第117-124页 |
| 七、综述一 | 第124-140页 |
| 八、综述二 | 第140-154页 |
| 九、附件 | 第154-171页 |
| 十、致谢 | 第171-172页 |
| 十一、攻读学位期间主要的研究成果 | 第172-175页 |
