| 利用人HLA Ⅰ类分子表型特异性细胞观察恶性疟原虫CTL表位的内源递呈及其与Ⅰ类分子的交连反应 | 第1-108页 |
| 中文摘要 | 第6-10页 |
| 英文摘要 | 第10-15页 |
| 前言 | 第15-20页 |
| 实验材料 | 第20-23页 |
| 1 主要仪器设备 | 第20页 |
| 2 试剂 | 第20-21页 |
| 2．1 分子生物学试剂 | 第20页 |
| 2．2 细胞培养和转染试剂 | 第20-21页 |
| 2．3 免疫和蛋白分离纯化试剂 | 第21页 |
| 3 质粒和细胞株 | 第21-22页 |
| 4 菌株 | 第22页 |
| 5 实验动物 | 第22页 |
| 6 DNA蛋白质序列分析软件 | 第22-23页 |
| 实验方法 | 第23-48页 |
| 1 表位微型基因DNA合成和重组质粒的构建 | 第23-29页 |
| 1．1 表位微型基因DNA的设计和合成 | 第23页 |
| 1．2 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)对部分互补的合成序列进平 | 第23-24页 |
| 1．3 DNA聚丙烯酰胺凝胶酸电泳 | 第24页 |
| 1．4 乙醇沉淀法回收PCR产物 | 第24页 |
| 1．5 质粒DNA的小量提取 | 第24-25页 |
| 1．6 DNA的限制性内切酶谱反应 | 第25-26页 |
| 1．7 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳回收 | 第26页 |
| 1．8 DNA片段的连接反应 | 第26-27页 |
| 1．9 感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 1．10 DNA转化感受态细菌 | 第27-28页 |
| 1．11 重组阳性克隆的鉴定 | 第28页 |
| 1．12 DNA序列的测定 | 第28页 |
| 1．13 应用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取和纯化质粒DNA | 第28-29页 |
| 2 细胞培养 | 第29-31页 |
| 2．1 细胞培养 | 第29-30页 |
| 2．2 细胞计数 | 第30页 |
| 2．3 细胞冻存 | 第30页 |
| 2．4 细胞复苏 | 第30页 |
| 2．5 细胞运输 | 第30-31页 |
| 3．Lipofectin介导的pcDNA3.1／β_2m的稳定转染 | 第31-32页 |
| 3．1 确定细胞克隆形成能力 | 第31页 |
| 3．2 确定杀死亲系细胞所需要的最低Zeocin浓度 | 第31页 |
| 3．3 转染和抗生素筛选 | 第31-32页 |
| 4．恶性疟CTL表位重组质粒转染入HLA Ⅰ类分子表型特异性细胞 | 第32-34页 |
| 4．1 Lipofectin介导的稳定转染 | 第32-33页 |
| 4．2 Lipofectin介导的瞬时转染 | 第33页 |
| 4．3 Lipofectamine介导的瞬时转染 | 第33-34页 |
| 5．RNA制备和RT-PCR | 第34-35页 |
| 5．1 TRIZOL Reagent分离总RNA | 第34页 |
| 5．2 RNA的 DNase Ⅰ消化 | 第34页 |
| 5．3 采用SUPERSCRIPT预扩增系统进行逆转录PCR | 第34-35页 |
| 6 抗表位肽兔多克隆抗血清的制备 | 第35-39页 |
| 6．1 肽段的合成 | 第36页 |
| 6．2 担体的选择 | 第36页 |
| 6．3 化学偶联法用间—马来酰亚胺苯甲酰基—N-羟基琥珀酰亚胺脂(MBS)将合成肽偶联到担体蛋白上 | 第36-37页 |
| 6．4 免疫兔产生多克隆抗血清 | 第37页 |
| 6．5 酶联免疫吸附测定 | 第37-38页 |
| 6．6 从抗血清中纯化IgG | 第38-39页 |
| 7 细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽结合检测 | 第39页 |
| 7．1 原理 | 第39页 |
| 7．2 C1R／HLA-A2.1和K562／HLA-B51细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽结合检测 | 第39页 |
| 7．3 C1R／HLA-A2.1,K562／HLA-B51,JY,KAS116,KT3,FUN,AMAI,GM3107八种细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽结合检测 | 第39页 |
| 8 免疫荧光染色和流式细胞仪分析 | 第39-40页 |
| 8．1 间接免疫荧光染色 | 第39-40页 |
| 8．2 直接免疫荧光染色 | 第40页 |
| 8．3 FITC和PE免疫双荧光染色 | 第40页 |
| 9 检测细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽复合物稳定性 | 第40-41页 |
| 10 细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽组装实验 | 第41页 |
| 11 免疫沉淀 | 第41-42页 |
| 11．1 需要的材料和溶液 | 第41-42页 |
| 11．2 实验流程 | 第42页 |
| 12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹检测 | 第42-48页 |
| 12．1 Laemmli凝胶电泳法 | 第42-44页 |
| 12．2 在Tris-Tricine缓冲系统中电泳 | 第44-45页 |
| 12．3 用转移槽转移蛋白 | 第45-46页 |
| 12．4 免疫印迹 | 第46-48页 |
| 实验结果 | 第48-91页 |
| 第一部分：恶性疟CTL表位微型基因在相应HLA Ⅰ类分子表型细胞中的表达和抗原递呈分析 | 第48-78页 |
| 1 真核表达重组质粒的构建 | 第48-57页 |
| 2 表位微型基因在人类特异性细胞株中的稳定表达 | 第57-59页 |
| 3 细胞表面MHC Ⅰ类分子表位肽结合检测的结果 | 第59-63页 |
| 4 外源β_2m的导入对细胞表面HLA Ⅰ类分子表达的影响 | 第63-68页 |
| 5 细胞表面MHC Ⅰ类分子-肽复合物稳定性检测 | 第68-72页 |
| 6 细胞表面MHC Ⅰ分子-肽组装实验的结果 | 第72-78页 |
| 第二部分：恶性疟原虫CTL表位在HLA Ⅰ类分子Supertype中的交连反应 | 第78-91页 |
| 1 分别含HLA-A2和HLA-B7超亚型共用肽段的表位的选择和设计以及重组质粒的构建 | 第78-79页 |
| 2 表达HLA-A2和HLA-B7超亚型内其它HLA Ⅰ类分子的细胞株的选择 | 第79-80页 |
| 3 表位微型基因的瞬时表达 | 第80-82页 |
| 4 流式细胞仪检测细胞表面Ⅰ类分子-内源表达肽的结合 | 第82-86页 |
| 5 细胞表面Ⅰ类分子-表位肽复合物稳定性检测 | 第86-89页 |
| 6 免疫共沉淀检测细胞表面Ⅰ类分子-内源表达肽的组装 | 第89-91页 |
| 讨论 | 第91-100页 |
| 结论 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 论文综述1：诱导杀伤性T细胞反应的恶性疟疫苗研究进展 | 第109-116页 |
| 论文综述2：HLA Ⅰ类分子结合亚型和共用肽段的发现及其意义 | 第116-126页 |
| 付录Ⅰ：博士生期间发表的文章和参加的会议 | 第126-127页 |
| 付录Ⅱ：英文缩写和翻译 | 第127页 |
