| 论文创新点 | 第5-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| ABSTRACT | 第14-15页 |
| 第一部分 CRISPR/Cas9技术介导的CXCR4的基因编辑赋予细胞抗HIV-1感染特性 | 第16-74页 |
| 第一章 研究背景 | 第16-44页 |
| 第一节 基因编辑技术 | 第16-26页 |
| 章节概述 | 第16-17页 |
| 1.1 基因编辑技术的发展简史 | 第17-18页 |
| 1.2 锌指酶技术简介 | 第18-19页 |
| 1.3 TALEN技术简介 | 第19-20页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术的发展 | 第20-24页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9系统的分子基础和工作原理 | 第24-25页 |
| 章节小结 | 第25-26页 |
| 第二节 获得性免疫缺陷病及其病原体HIV-1 | 第26-30页 |
| 章节概述 | 第26-27页 |
| 2.1 HIV-1的分子基础 | 第27页 |
| 2.2 HIV-1病毒的生活史 | 第27-30页 |
| 2.2.1 病毒的入侵 | 第27-28页 |
| 2.2.2 病毒DNA的合成 | 第28页 |
| 2.2.3 DNA链的整合,转录和表达 | 第28-29页 |
| 2.2.4 HIV病毒的包装、成熟和释放 | 第29页 |
| 2.2.5 病毒晚期调节基因 | 第29-30页 |
| 章节小结 | 第30页 |
| 第三节 与HIV病毒复制有关的宿主细胞蛋白 | 第30-36页 |
| 章节概述 | 第30-31页 |
| 3.1 病毒复制所需的宿主细胞辅助因子 | 第31-34页 |
| 3.1.1 病毒入侵的细胞受体CD4和辅助受体CCR5,CXCR4 | 第31-32页 |
| 3.1.2 辅助HIV病毒逆转录、整合和转录表达细胞因子 | 第32-34页 |
| 3.1.2.1 病毒脱壳和逆转录 | 第32-33页 |
| 3.1.2.2 逆转录DNA入核并整合 | 第33-34页 |
| 3.1.2.3 病毒的转录,加工,出核 | 第34页 |
| 3.1.2.4 病毒的蛋白翻译、装配、出芽与成熟 | 第34页 |
| 3.2 HIV-1病毒的限制因子 | 第34-36页 |
| 章节小结 | 第36页 |
| 第四节 艾滋病的治疗方法 | 第36-39页 |
| 章节概述 | 第36页 |
| 4.1 阻断HIV-1病毒侵入的药物 | 第36-37页 |
| 4.2 阻断病毒复制的其他时期的药物 | 第37-38页 |
| 4.2.1 逆转录酶抑制剂 | 第37页 |
| 4.2.2 整合酶抑制剂 | 第37-38页 |
| 4.2.3 蛋白酶抑制剂和融合抑制剂 | 第38页 |
| 4.3 HIV-1的抗药性 | 第38页 |
| 4.4 HIV-1病毒的疫苗研究 | 第38-39页 |
| 章节小结 | 第39页 |
| 第五节 基因编辑技术在艾滋病基因治疗中的应用 | 第39-43页 |
| 章节概述 | 第39-40页 |
| 5.1.1 锌指酶技术用于HIV基因治疗 | 第40-41页 |
| 5.1.2 锌指酶技术的应用限制 | 第41页 |
| 5.1.3 TALEN技术应用于HIV基因治疗 | 第41页 |
| 5.1.4 TALEN技术应用限制 | 第41页 |
| 5.1.5 CRISPR/Cas9系统用于HIV的基因治疗 | 第41-42页 |
| 5.1.6 CRISPR/Cas9系统技术应用限制 | 第42页 |
| 章节小结 | 第42-43页 |
| 第六节 本部分研究目的 | 第43-44页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第44-58页 |
| 2.1 实验仪器 | 第44页 |
| 2.2 实验试剂 | 第44-45页 |
| 2.3 质粒与细胞 | 第45-46页 |
| 2.4 工具酶与试剂盒 | 第46页 |
| 2.5 实验方法 | 第46-58页 |
| 2.5.1 引物设计 | 第46-47页 |
| 2.5.2 引物退火得到寡聚片段 | 第47-48页 |
| 2.5.3 酶切得到线性载体 | 第48页 |
| 2.5.4 将退火得到的寡聚片段连接到酶切后的载体 | 第48页 |
| 2.5.5 转化 | 第48-49页 |
| 2.5.6 提取质粒并测序鉴定 | 第49页 |
| 2.5.7 转染 | 第49-50页 |
| 2.5.8 慢病毒的包装和HIV-1NL4-3扩增以及病毒滴度测定 | 第50-51页 |
| 2.5.9 慢病毒转导 | 第51页 |
| 2.5.10 细胞基因组DNA提取 | 第51-52页 |
| 2.5.11 PCR扩增目的基因靶序列片段 | 第52页 |
| 2.5.12 胶回收PCR片段 | 第52-53页 |
| 2.5.13 T7EN1实验 | 第53页 |
| 2.5.14 TA克隆 | 第53-54页 |
| 2.5.15 流式细胞技术 | 第54页 |
| 2.5.16 Western blots检测蛋白表达 | 第54-55页 |
| 2.5.17 酚氯仿法提取真核细胞总mRNA:以12孔板贴壁细胞为例 | 第55页 |
| 2.5.18 逆转录 | 第55-56页 |
| 2.5.19 荧光定量PCR:以Roche FastStart Universal SYBR GreenMaster(ROX)为例 | 第56页 |
| 2.5.20 p24 ELISA试剂盒检测HIV-1核心抗原 | 第56-57页 |
| 2.5.21 脱靶效应分析 | 第57页 |
| 2.5.22 统计与分析 | 第57-58页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第58-74页 |
| 3.1 设计并筛选出有效的CXCR4的gRNA | 第58-60页 |
| 3.2 LentiCRISPR/Cas9慢病毒介导的更为高效的基因编辑 | 第60-62页 |
| 3.3 lentiCRISPR/Cas9介导的CXCR4的基因缺失赋予细胞抗HIV-1感染的特性 | 第62-65页 |
| 3.4 CRISPR/Cas9系统可保护编辑的Jurkat T细胞不被HIV-1病毒感染 | 第65-67页 |
| 3.5 CRISPR/Cas9修饰后的原代CD4+T细胞可抗HIV-1病毒感染 | 第67-69页 |
| 3.6 LentiCRISPR/Cas9系统的特异性和细胞毒性检测 | 第69-71页 |
| 3.7 讨论与展望 | 第71-74页 |
| 第二部分 基于CRISPR/Cas9技术对AML抗药性相关基因的筛选和机制研究 | 第74-119页 |
| 第四章 急性髓系白血病 | 第74-89页 |
| 第一节 急性髓系白血病的分类与鉴定 | 第74-79页 |
| 章节概述 | 第74-75页 |
| 4.1.1 白血病简介 | 第75-76页 |
| 4.1.2 急性髓系白血病 | 第76-77页 |
| 4.1.3 急性髓系白血病的分型及相关的遗传学特征 | 第77-79页 |
| 章节小结 | 第79页 |
| 第二节 FMS-like tyrosine kinase receptor 3(FLT3) | 第79-82页 |
| 章节概述 | 第79页 |
| 4.2.1 酪氨酸激酶受体3(FLT3)简介 | 第79-80页 |
| 4.2.2 FLT3的突变类型 | 第80-81页 |
| 4.2.3 FLT3的配体FLT3L | 第81页 |
| 4.2.4 突变的FLT3下游信号通路 | 第81-82页 |
| 章节总结 | 第82页 |
| 第三节 急性髓系白血病的治疗 | 第82-88页 |
| 章节概述 | 第82页 |
| 4.3.1 常规的AML疗法 | 第82-84页 |
| 4.3.2 新型AML药物 | 第84-88页 |
| 4.3.2.1 Vosaroxin | 第84页 |
| 4.3.2.2 CPX-351 | 第84-85页 |
| 4.3.2.3 表观遗传修饰类药物 | 第85页 |
| 4.3.2.4 FLT3抑制剂 | 第85-87页 |
| 4.3.2.5 单克隆抗体 | 第87-88页 |
| 章节小结 | 第88页 |
| 第四节 本部分研究的目的 | 第88-89页 |
| 第五章 材料与方法 | 第89-96页 |
| 5.1 实验器材与材料 | 第89-90页 |
| 5.2 细胞与病人样本 | 第90页 |
| 5.3 实验方法 | 第90-96页 |
| 5.3.1 引物设计与合成 | 第90-92页 |
| 5.3.2 扩增GeCKO v2文库 | 第92页 |
| 5.3.3 慢病毒包装文库 | 第92-93页 |
| 5.3.4 慢病毒文库转导 | 第93页 |
| 5.3.5 抗药性细胞筛选:以12孔板为例 | 第93页 |
| 5.3.6 基因组DNA测序 | 第93-94页 |
| 5.3.7 核转仪电转原代细胞 | 第94页 |
| 5.3.8 单克隆细胞培养 | 第94页 |
| 5.3.9 细胞毒性测定 | 第94-95页 |
| 5.3.10 数据处理 | 第95-96页 |
| 第六章 实验结果与讨论 | 第96-119页 |
| 6.1 引言 | 第96-98页 |
| 6.2 在AML细胞中进行全基因组水平的筛选 | 第98-101页 |
| 6.3 在MV4-11细胞中验证SPRY3和GSK3的单个基因敲除的细胞的抗药性 | 第101-103页 |
| 6.4 SPRY3缺失的原代AML病人细胞显示了更高的耐药性 | 第103-105页 |
| 6.5 抗药性机制探究:SPRY3缺失或GSK3的抑制重新激活被AC220抑制的FLT3下游信号通路 | 第105-109页 |
| 6.6 药物抑制MAPK和Wnt信号通路增强了AML细胞对AC220的敏感性 | 第109-112页 |
| 6.7 在GSK3敲除的细胞中SPRY3的表达量降低 | 第112-113页 |
| 6.8 SPRY3同源蛋白的功能验证以及lentiCRISPR脱靶效应检测 | 第113-116页 |
| 6.9 讨论与展望 | 第116-119页 |
| 参考文献 | 第119-134页 |
| 在读期间参与发表的论文 | 第134-135页 |
| 致谢 | 第135-136页 |
