| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 缩略词 | 第16-18页 |
| 总前言 | 第18-20页 |
| 第一章 基于IDH1蛋白结构的抗癌药物筛选与活性评价 | 第20-70页 |
| 前言 | 第20-22页 |
| 第一节 以IDH1突变酶为靶点的已知药物虚拟筛选 | 第22-25页 |
| 1.实验仪器和方法 | 第22-23页 |
| 1.1 虚拟筛选计算机 | 第22页 |
| 1.2 IDH1突变酶蛋白质晶体结构及其处理 | 第22页 |
| 1.3 数据库 | 第22页 |
| 1.4 虚拟筛选 | 第22页 |
| 1.5 化合物分析 | 第22-23页 |
| 2.结果与讨论 | 第23-25页 |
| 第二节 IDH1、IDH1R132H、IDH1R132C的表达与纯化 | 第25-37页 |
| 1 实验仪器与材料 | 第25-30页 |
| 1.1 质粒载体 | 第25页 |
| 1.2 大肠杆菌菌株 | 第25-26页 |
| 1.3 基因 | 第26页 |
| 1.4 引物设计 | 第26-27页 |
| 1.5 实验仪器 | 第27-28页 |
| 1.6 实验材料 | 第28-29页 |
| 1.7 常用试剂配制 | 第29-30页 |
| 2 IDH1蛋白表达与纯化 | 第30-35页 |
| 2.1 pET28a-IDH1重组质粒的构建 | 第30-33页 |
| 2.2 目的蛋白的诱导表达 | 第33页 |
| 2.3 蛋白表达检测 | 第33-34页 |
| 2.4 IDH1、IDH1R132H、IDH1R132C的大量表达与纯化 | 第34-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-37页 |
| 第三节 IDH1体外酶活性抑制筛选及解离常数测定 | 第37-46页 |
| 1 实验仪器与材料 | 第38-39页 |
| 1.1 实验仪器 | 第38页 |
| 1.2 实验材料 | 第38-39页 |
| 2 实验方法 | 第39-41页 |
| 2.1 IDH1酶抑制活性筛选 | 第39-40页 |
| 2.2 微量热泳动实验 | 第40-41页 |
| 3.结果与讨论 | 第41-46页 |
| 3.1 虚拟筛选化合物对IDH1、IDH1R132H、IDH1R132C酶活性的抑制作用 | 第41-43页 |
| 3.2 克罗米芬酶活性抑制的选择性及酶促反应动力学研究 | 第43页 |
| 3.3 克罗米芬与AGI-5198酶作用机制比较 | 第43-44页 |
| 3.4 克罗米芬以及AGI-5198与IDH1R132H的Kd值测定 | 第44-46页 |
| 第四节 克罗米芬的体外、体内抗肿瘤活性研究 | 第46-59页 |
| 1.实验仪器与材料 | 第46-47页 |
| 1.1 实验仪器 | 第46页 |
| 1.2 实验材料 | 第46-47页 |
| 1.3 实验动物 | 第47页 |
| 2.实验方法 | 第47-52页 |
| 2.1 HT1080细胞内2-HG的含量测定 | 第47-48页 |
| 2.2 WesternBlot | 第48-49页 |
| 2.3 细胞凋亡检测 | 第49-50页 |
| 2.4 shRNA实验 | 第50页 |
| 2.5 CCK-8细胞毒性效应 | 第50页 |
| 2.6 免疫荧光实验 | 第50-51页 |
| 2.7 动物实验分组及给药 | 第51-52页 |
| 3 结果与讨论 | 第52-57页 |
| 3.1 克罗米芬对HT1080细胞中2-HG含量的影响 | 第52-53页 |
| 3.2 克罗米芬对HT1080细胞中H3K9me3表达量的影响 | 第53页 |
| 3.3 克罗米芬促进HT1080细胞凋亡 | 第53-54页 |
| 3.4 克罗米芬的作用靶点确证 | 第54-55页 |
| 3.5 克罗米芬的体内抗肿瘤活性评价 | 第55-56页 |
| 3.6 肿瘤组织与血清中2-HG含量的测定 | 第56页 |
| 3.7 IHC分析结果 | 第56-57页 |
| 3.8 克罗米芬对小鼠肝、脾、肾组织形态的影响 | 第57页 |
| 4 小结 | 第57-59页 |
| 第五节 以IDH1为靶点的天然产物的虚拟筛选及活性评价 | 第59-68页 |
| 1 发现ASPERSPIROPENEA为癌症代谢关键酶IDH1的抑制剂 | 第59-62页 |
| 2 发现灵芝提取物天然类固醇化合物WM-49为突变IDH1的新性抑制剂 | 第62-68页 |
| 总结与展望 | 第68-70页 |
| 第二章 基于TOPK结构的化合物数据库虚拟筛选、活性评价 | 第70-127页 |
| 前言 | 第70-72页 |
| 第一节 TOPK蛋白的表达与纯化 | 第72-83页 |
| 1 材料与方法 | 第72-73页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第72页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第72页 |
| 1.3 TOPK的氨基酸序列和基因序列 | 第72-73页 |
| 1.4 PCR引物的设计 | 第73页 |
| 2 实验方法 | 第73-79页 |
| 2.1 杆状病毒质粒构建 | 第73页 |
| 2.2 将重组正确的质粒,转化入DH10Bac感受态 | 第73-74页 |
| 2.3 从DH10Bac中提取Bacmid(杆状病毒载体构建) | 第74-75页 |
| 2.4 杆状病毒质粒转染昆虫细胞及病毒扩增 | 第75-77页 |
| 2.5 蛋白小量表达检测 | 第77页 |
| 2.6 SF9细胞的冻存及复苏 | 第77-78页 |
| 2.7 大量表达病毒扩增 | 第78-79页 |
| 2.8 TOPK大量表达 | 第79页 |
| 3.结果与讨论 | 第79-83页 |
| 第二节 TOPK结晶条件的探索 | 第83-86页 |
| 1 实验仪器和材料 | 第83页 |
| 1.1 实验仪器 | 第83页 |
| 1.2 实验材料 | 第83页 |
| 2 实验方法 | 第83-85页 |
| 2.1 蛋白质结晶条件的筛选 | 第83-84页 |
| 2.2 结晶条件的进一步优化 | 第84页 |
| 2.3 蛋白晶体衍射数据收集 | 第84-85页 |
| 3 结果与讨论 | 第85-86页 |
| 第三节 质子泵抑制艾普拉唑靶向TOPK抑制肿瘤的生长 | 第86-97页 |
| 1 实验方法 | 第86-88页 |
| 1.1 基于TOPK结构的虚拟筛选 | 第86页 |
| 1.2 MST测定化合物与TOPK酶的结合能力 | 第86页 |
| 1.3 细胞内信号通路实验 | 第86-87页 |
| 1.4 化合物作用于TOPK靶点的确证实验 | 第87页 |
| 1.5 细胞核Hoechst33342染色 | 第87页 |
| 1.6 细胞周期检测(G1) | 第87-88页 |
| 1.7 小鼠移植性肿瘤实验 | 第88页 |
| 2.结果与讨论 | 第88-94页 |
| 2.1 MST(微量热泳动仪)测定质子泵抑制剂与TOPK酶的结合能力 | 第88-90页 |
| 2.2 艾普拉唑体外抗癌细胞增殖作用 | 第90-91页 |
| 2.3 艾普拉唑在细胞水平抑制TOPK,诱导细胞凋亡 | 第91-92页 |
| 2.4 敲低TOPK减弱艾普拉唑对TOPK高表达癌细胞的生长抑制作用 | 第92-93页 |
| 2.5 艾普拉唑在体内通过抑制TOPK而阻断肿瘤的生长 | 第93-94页 |
| 3 小结 | 第94-97页 |
| 第四节 HJ001靶向TOPK激酶抑制肿瘤生长,提高荷瘤小鼠生存率 | 第97-126页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第97-98页 |
| 1.1 材料 | 第97页 |
| 1.2 仪器 | 第97-98页 |
| 2 实验方法 | 第98-103页 |
| 3 结果与讨论 | 第103-125页 |
| 3.1 虚拟筛选预测HJ001能和TOPK结合,抑制HCT116细胞生长 | 第103-104页 |
| 3.2 HJ001对SW1990和HCT116细胞增殖能力的影响 | 第104-107页 |
| 3.2.1 CCK-8法检测 | 第104页 |
| 3.2.2 EdU法检测 | 第104-106页 |
| 3.2.3 免疫荧光检测增殖相关抗原Ki-67的表达 | 第106页 |
| 3.2.4 HJ001明显抑制HCT116细胞的克隆形成 | 第106-107页 |
| 3.3 HJ001诱导TOPK高表达肿瘤细胞凋亡 | 第107-110页 |
| 3.3.1 细胞核Hoechst33342染色 | 第107页 |
| 3.3.2 AnnexinV/PI凋亡双染 | 第107-108页 |
| 3.3.3 免疫荧光检测caspase3的表达水平 | 第108-109页 |
| 3.3.4 HJ001对TOPK高表达细胞的细胞周期的影响 | 第109-110页 |
| 3.4 HJ001对ES-2、SW1990和HCT116细胞迁移能力的影响 | 第110-111页 |
| 3.5 HJ001对TOPK下游HistoneH3磷酸化的影响 | 第111-112页 |
| 3.6 HJ001对细胞内p-21,p-CDC2,p53,p-RSK表达水平的影响 | 第112-113页 |
| 3.7 HJ001对正常细胞LO2,Vero的存活率的影响 | 第113页 |
| 3.8 敲低HCT116细胞内TOPK的表达后,HJ001对细胞存活率的影响 | 第113-114页 |
| 3.9 HCT116细胞中CETSA热迁移实验 | 第114-115页 |
| 3.10 HJ001在体内通过抑制TOPK而阻断肿瘤的生长 | 第115-125页 |
| 3.10.1 HJ001对A549异种移植小鼠模型中非小细胞肺癌生长的影响 | 第115-118页 |
| 3.10.2 HJ001对HCT116异种移植小鼠模型中结肠癌生长的影响 | 第118-119页 |
| 3.10.3 HJ001抑制荷瘤小鼠体内胰腺癌的生长及转移 | 第119-124页 |
| 3.10.4 HJ001影响荷瘤CB-17/Icr-scid小鼠的生存率 | 第124-125页 |
| 4.小结 | 第125-126页 |
| 总结与展望 | 第126-127页 |
| 参考文献 | 第127-136页 |
| 综述 | 第136-160页 |
| 参考文献 | 第149-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
