| 摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 第1章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 海藻糖概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 海藻糖的来源与性质 | 第12-13页 |
| 1.1.2 海藻糖的功能及应用 | 第13-14页 |
| 1.2 海藻糖合酶研究进展 | 第14-16页 |
| 1.2.1 海藻糖合酶的来源与性质 | 第14-15页 |
| 1.2.2 海藻糖合酶的结构与催化机制 | 第15-16页 |
| 1.3 蛋白质分子改造研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第16-17页 |
| 1.3.2 定点突变技术 | 第17页 |
| 1.3.3 定点饱和突变技术 | 第17-18页 |
| 1.3.4 海藻糖合酶修饰研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第19-21页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统简介 | 第19页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达载体及启动子 | 第19-20页 |
| 1.4.3 毕赤酵母表达影响因素及发酵策略 | 第20-21页 |
| 1.5 课题研究背景及内容 | 第21-22页 |
| 1.5.1 立题背景 | 第21页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第21-22页 |
| 第2章 海藻糖合酶分子改造及酶学性质分析 | 第22-42页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 药品与试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.3 仪器与设备 | 第23-24页 |
| 2.2.4 主要试剂与培养基配制 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-30页 |
| 2.3.1 海藻糖合酶的同源建模及分子对接 | 第25页 |
| 2.3.2 不同来源的海藻糖合酶氨基酸序列比对 | 第25页 |
| 2.3.3 饱和突变库的构建 | 第25-27页 |
| 2.3.4 突变体库的诱导表达及筛选 | 第27-28页 |
| 2.3.5 突变酶活性检测及转化率计算 | 第28页 |
| 2.3.6 突变酶的镍柱纯化 | 第28-29页 |
| 2.3.7 优势位点的叠加分析 | 第29页 |
| 2.3.8 突变酶的最适温度及热稳定性分析 | 第29页 |
| 2.3.9 突变酶的最适pH及pH耐受性分析 | 第29页 |
| 2.3.10 突变酶的动力学参数分析 | 第29-30页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第30-40页 |
| 2.4.1 海藻糖合酶活性中心分析及饱和突变位点的选择 | 第30-33页 |
| 2.4.2 饱和突变库的构建 | 第33-34页 |
| 2.4.3 突变子的筛选 | 第34-36页 |
| 2.4.4 突变酶的最适温度及热稳定性 | 第36-37页 |
| 2.4.5 突变酶的最适pH及pH耐受性 | 第37页 |
| 2.4.6 突变酶的动力学参数 | 第37-38页 |
| 2.4.7 突变位点的分析 | 第38-40页 |
| 2.5 本章小结 | 第40-42页 |
| 第3章 突变型海藻糖合酶在毕赤酵母中的胞内表达 | 第42-56页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42-44页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第42页 |
| 3.2.2 试剂与药品 | 第42-43页 |
| 3.2.3 仪器与设备 | 第43页 |
| 3.2.4 主要试剂与培养基配制 | 第43-44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.3.1 pET-15b-tres3质粒的提取 | 第44页 |
| 3.3.2 PCR扩增海藻糖合酶基因 | 第44-45页 |
| 3.3.3 pGAPZαA质粒的提取 | 第45页 |
| 3.3.4 重组T载体的构建及菌落PCR | 第45-46页 |
| 3.3.5 pGAPZαA-tres3的构建及阳性验证 | 第46-47页 |
| 3.3.6 pGAPZαA-tres3的线性化及浓缩 | 第47页 |
| 3.3.7 毕赤酵母感受态的制备与转化 | 第47-48页 |
| 3.3.8 重组毕赤酵母GS115/pGAPZαA-tres3的验证及高拷贝筛选 | 第48页 |
| 3.3.9 阳性重组子蛋白表达及活性检测 | 第48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-55页 |
| 3.4.1 重组表达载体构建流程 | 第48-49页 |
| 3.4.2 海藻糖合酶基因的获取 | 第49页 |
| 3.4.3 重组T载体的构建及菌落PCR | 第49-50页 |
| 3.4.4 重组质粒pGAPZαA-tres3的构建及验证 | 第50-52页 |
| 3.4.5 重组毕赤酵母GS115/pGAPZαA-tres3的构建 | 第52-53页 |
| 3.4.6 海藻糖合酶的检测及酶活测定 | 第53-55页 |
| 3.5 本章小结 | 第55-56页 |
| 第4章 重组毕赤酵母的发酵优化及5L发酵 | 第56-66页 |
| 4.1 引言 | 第56页 |
| 4.2 实验材料 | 第56-57页 |
| 4.2.1 实验菌株 | 第56页 |
| 4.2.2 实验药品 | 第56页 |
| 4.2.3 仪器设备 | 第56页 |
| 4.2.4 主要试剂与培养基配制 | 第56-57页 |
| 4.3 实验方法 | 第57-58页 |
| 4.3.1 菌株活化及酶活力测定 | 第57页 |
| 4.3.2 碳源对海藻糖合酶发酵的影响 | 第57页 |
| 4.3.3 碳源浓度对海藻糖合酶发酵的影响 | 第57页 |
| 4.3.4 氮源对海藻糖合酶发酵的影响 | 第57-58页 |
| 4.3.5 氮源浓度对海藻糖合酶发酵的影响 | 第58页 |
| 4.3.6 金属离子对海藻糖合酶发酵的影响 | 第58页 |
| 4.3.7 发酵条件对海藻糖合酶发酵的影响 | 第58页 |
| 4.3.8 不同补料方式对海藻糖合酶发酵的影响 | 第58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-64页 |
| 4.4.1 碳源对海藻糖合酶发酵的影响 | 第58-59页 |
| 4.4.2 葡萄糖浓度对海藻糖合酶发酵的影响 | 第59页 |
| 4.4.3 氮源对海藻糖合酶发酵的影响 | 第59-60页 |
| 4.4.4 复合氮源浓度对海藻糖合酶发酵的影响 | 第60-61页 |
| 4.4.5 添加金属离子对海藻糖合酶发酵的影响 | 第61页 |
| 4.4.6 发酵条件对海藻糖合酶发酵的影响 | 第61-62页 |
| 4.4.7 不同补料方式对海藻糖合酶发酵的影响 | 第62-64页 |
| 4.5 本章小结 | 第64-66页 |
| 第5章 总结与展望 | 第66-68页 |
| 5.1 总结 | 第66页 |
| 5.2 展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 致谢 | 第74-76页 |
| 在学期间主要科研成果 | 第76页 |
