| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第8-13页 |
| 1.1 引言 | 第8-10页 |
| 1.2 EGFR基因突变检查发展状况 | 第10-12页 |
| 1.3 论文研究目的和内容 | 第12-13页 |
| 第二章 EGFR18、19、20、21四个外显子的TA克隆 | 第13-25页 |
| 2.1 实验材料 | 第13-14页 |
| 2.1.1 实验标本 | 第13页 |
| 2.1.2 仪器 | 第13页 |
| 2.1.3 试剂及培养基 | 第13-14页 |
| 2.2 实验内容 | 第14-19页 |
| 2.2.1 细胞基因组DNA提取 | 第14页 |
| 2.2.2 引物设计及合成 | 第14-15页 |
| 2.2.3 PCR反应体系 | 第15-16页 |
| 2.2.4 目的片段回收 | 第16页 |
| 2.2.5 目的基因与载体的连接 | 第16页 |
| 2.2.6 转化 | 第16-17页 |
| 2.2.7 质粒鉴定 | 第17-19页 |
| 2.2.8 测序鉴定 | 第19页 |
| 2.3 试验结果 | 第19-23页 |
| 2.3.1 EGFR四个外显子引物设计结果 | 第19页 |
| 2.3.2 目的基因的获取 | 第19-20页 |
| 2.3.3 质粒提取鉴定 | 第20-21页 |
| 2.3.4 PCR鉴定结果 | 第21页 |
| 2.3.5 测序结果 | 第21-23页 |
| 2.4 结果讨论 | 第23页 |
| 2.5 小结 | 第23-25页 |
| 第三章 29种基因突变体的构建 | 第25-48页 |
| 3.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 3.1.1 菌株 | 第26页 |
| 3.1.2 仪器 | 第26页 |
| 3.1.3 试剂及培养基 | 第26-27页 |
| 3.2 实验内容 | 第27-33页 |
| 3.2.1 质粒提取 | 第27页 |
| 3.2.2 引物设计及合成 | 第27-29页 |
| 3.2.3 第一轮PCR | 第29页 |
| 3.2.4 第二轮PCR | 第29-30页 |
| 3.2.5 目的基因与载体的连接 | 第30-31页 |
| 3.2.6 转化 | 第31-32页 |
| 3.2.7 质粒鉴定 | 第32页 |
| 3.2.8 克隆质粒的PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 3.2.9 一代测序验证 | 第33页 |
| 3.3 试验结果 | 第33-46页 |
| 3.3.1 用于重叠延伸突变的引物设计结果 | 第33-37页 |
| 3.3.2 第一轮PCR | 第37-39页 |
| 3.3.3 第二轮PCR | 第39-41页 |
| 3.3.4 质粒提取鉴定 | 第41-43页 |
| 3.3.5 PCR鉴定结果 | 第43-45页 |
| 3.3.6 测序结果 | 第45-46页 |
| 3.4 结果讨论 | 第46-47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 EGFR基因突变检测体系的构建 | 第48-69页 |
| 4.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 4.1.1 菌株来源 | 第48页 |
| 4.1.2 试剂和仪器 | 第48-49页 |
| 4.1.3 培养基及试剂配置 | 第49页 |
| 4.2 实验内容 | 第49-53页 |
| 4.2.1 EGFR基因突变阴性细胞基因组DNA的抽提 | 第49-50页 |
| 4.2.2 阳性参考品的配置 | 第50页 |
| 4.2.3 反应体系检测管的设置 | 第50-51页 |
| 4.2.4 引物及探针设计 | 第51-52页 |
| 4.2.5 ARMS引物的筛选 | 第52-53页 |
| 4.2.6 灵敏度实验 | 第53页 |
| 4.2.7 分辨率实验 | 第53页 |
| 4.2.8 特异性实验 | 第53页 |
| 4.3 实验结果 | 第53-67页 |
| 4.3.1 人细胞基因组DNA提取结果 | 第53-54页 |
| 4.3.2 探针设计结果 | 第54-55页 |
| 4.3.3 引物筛选结果 | 第55-57页 |
| 4.3.4 特异性结果 | 第57-58页 |
| 4.3.5 灵敏度结果 | 第58-64页 |
| 4.3.6 分辨率结果 | 第64-67页 |
| 4.4 结果讨论 | 第67页 |
| 4.5 小结 | 第67-69页 |
| 第五章 临床样本的检测 | 第69-82页 |
| 5.1 实验材料 | 第69-70页 |
| 5.1.1 样本来源 | 第69页 |
| 5.1.2 试剂和仪器 | 第69-70页 |
| 5.1.3 试剂配置 | 第70页 |
| 5.2 实验内容 | 第70-74页 |
| 5.2.1 石蜡切片基因组DNA的提取 | 第70-71页 |
| 5.2.2 cutoff值的确定 | 第71-72页 |
| 5.2.3 检测结果统计 | 第72-73页 |
| 5.2.4 与厦门艾德EGFR基因突变检测试剂盒的对比 | 第73页 |
| 5.2.5 测序验证 | 第73-74页 |
| 5.3 实验结果 | 第74-80页 |
| 5.3.1 cutoff值的确定结果 | 第74-76页 |
| 5.3.2 本文构建的ARMS方法检测结果的统计结果 | 第76-77页 |
| 5.3.3 与艾德EGFR基因突变检测试剂盒的对比结果 | 第77-78页 |
| 5.3.4 测序验证结果 | 第78-80页 |
| 5.4 结果讨论 | 第80-81页 |
| 5.5 小结 | 第81-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-88页 |
| 附表1 第一轮E19PCR结果 | 第88-90页 |
| 附表2 第二轮E19PCR结果 | 第90-91页 |
| 附表3 E19质粒PCR鉴定结果 | 第91-92页 |
| 附表4 EGFR基因29种基因突变质粒测序结果 | 第92-101页 |
