| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-53页 |
| 第一节 手性药物拆分技术研究进展及应用 | 第15-23页 |
| 1.1 手性及手性技术研究概况 | 第15-16页 |
| 1.2 手性化合物拆分的方法 | 第16-23页 |
| 1.2.1 酶法拆分 | 第16-17页 |
| 1.2.2 化学拆分法 | 第17-18页 |
| 1.2.3 色谱拆分法 | 第18-19页 |
| 1.2.4 膜拆分法 | 第19-20页 |
| 1.2.5 萃取拆分 | 第20页 |
| 1.2.6 旋转带蒸馏技术 | 第20-21页 |
| 1.2.7 结晶拆分 | 第21-23页 |
| 第二节 酰胺酶研究进展及应用 | 第23-48页 |
| 2.1 酰胺酶概况 | 第23-27页 |
| 2.2 酰胺酶分类 | 第27-28页 |
| 2.3 酰胺酶进化 | 第28-29页 |
| 2.4 酰胺酶参与的生物催化反应 | 第29页 |
| 2.5 酰胺酶理化性质 | 第29-35页 |
| 2.7 酰胺酶底物特异性和酶的立体选择性 | 第35-37页 |
| 2.8 热稳定性 | 第37-41页 |
| 2.9 氨基酸序列同源性 | 第41页 |
| 2.10 酰胺酶反应机理 | 第41-42页 |
| 2.11 酰胺酶分子生物学 | 第42-47页 |
| 2.12 展望 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-53页 |
| 第二章 氨肽酶B对酰胺及酰胺衍生物拆分作用研究 | 第53-77页 |
| 第一节 氨肽酶B基因工程菌构建 | 第53-60页 |
| 1.1 实验材料 | 第53-54页 |
| 1.1.1 主要实验试剂 | 第53页 |
| 1.1.2 主要实验仪器 | 第53-54页 |
| 1.1.3 培养基 | 第54页 |
| 1.2 实验方法 | 第54-56页 |
| 1.2.1 氨肽酶B基因工程菌(pET-28a-pepB/BL21)构建 | 第54-56页 |
| 1.2.2 氨肽酶(Pep B)工程菌诱导表达 | 第56页 |
| 1.2.3 氨肽酶(Pep B)活性测定 | 第56页 |
| 1.3 实验结果 | 第56-60页 |
| 1.3.1 重组质粒pET-28a-pepB构建 | 第56-58页 |
| 1.3.2 氨肽酶(PepB)基因工程菌诱导表达 | 第58-59页 |
| 1.3.3 氨肽酶(PepB)活性测定 | 第59-60页 |
| 1.4 结论 | 第60页 |
| 第二节 化学酶法合成D/L-丝氨酸 | 第60-69页 |
| 2.1 实验材料 | 第61页 |
| 2.1.1 菌种 | 第61页 |
| 2.1.2 仪器与试剂 | 第61页 |
| 2.2 实验方法 | 第61-63页 |
| 2.2.1 实验路线 | 第61-62页 |
| 2.2.2 甲醇钠制备 | 第62页 |
| 2.2.3 α-溴-β-甲氧基丙酰胺制备 | 第62页 |
| 2.2.4 α-氨基-β-甲氧基丙酰胺制备 | 第62页 |
| 2.2.5 L-3-甲氧基丙氨酸标准曲线的绘制 | 第62页 |
| 2.2.6 氨肽酶PepB拆分反应 | 第62-63页 |
| 2.2.7 酶活性定义 | 第63页 |
| 2.2.8 D/L丝氨酸制备 | 第63页 |
| 2.3 实验结果 | 第63-68页 |
| 2.3.1 醇钠的影响 | 第63页 |
| 2.3.2 丙烯酰胺加成反应溶剂和滴加条件 | 第63-64页 |
| 2.3.3 氨解条件 | 第64页 |
| 2.3.4 L-3-甲氧基丙氨酸标准工作曲线 | 第64页 |
| 2.3.5 转化温度对细胞酶活影响 | 第64-66页 |
| 2.3.6 pH对酶促反应影响 | 第66页 |
| 2.3.7 底物浓度及反应时间对酶活影响 | 第66-68页 |
| 2.3.8 金属离子对酶活影响 | 第68页 |
| 2.3.9 D-和L-丝氨酸制备 | 第68页 |
| 2.4 结论 | 第68-69页 |
| 第三节 酶法合成L-2-氨基脂肪酸 | 第69-76页 |
| 3.1 实验材料 | 第70页 |
| 3.1.1 菌株 | 第70页 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 | 第70页 |
| 3.2 实验方法 | 第70-71页 |
| 3.2.1 实验路线 | 第70页 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺制备 | 第70-71页 |
| 3.2.3 酶转化反应 | 第71页 |
| 3.3 实验结果 | 第71-75页 |
| 3.3.1 2-Br脂肪酸甲酯氨解过程监测 | 第71-74页 |
| 3.3.2 酶促拆分进程 | 第74页 |
| 3.3.3 产物纯度及产率 | 第74-75页 |
| 3.4 结论 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-77页 |
| 第三章 D型酰胺水解酶对酰胺类化合物拆分作用研究 | 第77-101页 |
| 第一节 D型酰胺水解酶基因工程菌构建 | 第78-88页 |
| 1.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 1.1.1 主要实验试剂 | 第78-79页 |
| 1.1.2 主要实验仪器 | 第79页 |
| 1.1.3 培养基 | 第79页 |
| 1.2 实验方法 | 第79-82页 |
| 1.2.1 DaaA基因工程菌(pET-Duet-daaA/ BL21)构建 | 第79-82页 |
| 1.2.2 D型酰胺水解酶DaaA工程菌诱导表达 | 第82页 |
| 1.2.3 D型酰胺水解酶DaaA酶活性测定 | 第82页 |
| 1.3 实验结果 | 第82-88页 |
| 1.3.1 重组质粒pET-Duet-daaA构建 | 第82-86页 |
| 1.3.2 D型酰胺水解酶DaaA工程菌诱导表达 | 第86-87页 |
| 1.3.3 D型酰胺水解酶DaaA酶活性测定 | 第87-88页 |
| 1.4 结论 | 第88页 |
| 第二节 D/L苯丙氨酸的酶法制备 | 第88-97页 |
| 2.1 实验材料 | 第89页 |
| 2.1.1 菌种 | 第89页 |
| 2.1.2 仪器与试剂 | 第89页 |
| 2.2 实验方法 | 第89-91页 |
| 2.2.1 实验路线 | 第89-90页 |
| 2.2.2 DL-苯丙酰胺化学合成 | 第90页 |
| 2.2.3 D型酰胺酶DaaA菌体培养及收集 | 第90-91页 |
| 2.2.4 D型苯丙氨酸标准曲线绘制 | 第91页 |
| 2.2.5 酶法转化及酶活测定 | 第91页 |
| 2.3 实验结果 | 第91-96页 |
| 2.3.1 D型苯丙氨酸标准工作曲线 | 第91页 |
| 2.3.2 反应温度对酶活影响 | 第91-93页 |
| 2.3.3 反应pH值对酶活影响 | 第93页 |
| 2.3.4 表面活性剂对酶活影响 | 第93-94页 |
| 2.3.5 底物浓度对酶活影响 | 第94-95页 |
| 2.3.6 金属离子对酶活影响 | 第95页 |
| 2.3.7 酶促反应进程 | 第95页 |
| 2.3.8 D-和L-苯丙氨酸制备 | 第95-96页 |
| 2.4 结论 | 第96-97页 |
| 第三节 D型酰胺酶法制备D-2-氨基脂肪酸 | 第97-100页 |
| 3.1 实验材料 | 第97-98页 |
| 3.1.1 菌株 | 第97页 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 | 第97-98页 |
| 3.2 实验方法 | 第98页 |
| 3.2.1 实验路线 | 第98页 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺制备 | 第98页 |
| 3.2.3 酶转化反应 | 第98页 |
| 3.3 实验结果 | 第98-99页 |
| 3.3.1 酶促拆分进程 | 第98-99页 |
| 3.3.2 产物纯度及产率 | 第99页 |
| 3.5 结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-101页 |
| 第四章 双酶法制备D/L氨基酸 | 第101-128页 |
| 第一节 己内酰胺消旋酶(ACLR)基因工程菌构建 | 第102-114页 |
| 1.1 实验材料 | 第102-103页 |
| 1.1.1 主要实验试剂 | 第102-103页 |
| 1.1.2 主要实验仪器 | 第103页 |
| 1.1.3 培养基 | 第103页 |
| 1.2 实验方法 | 第103-106页 |
| 1.2.1 ACLR基因工程菌(pET-Duet-aclR/ BL21)构建 | 第103-105页 |
| 1.2.2 ACLR基因工程菌诱导表达 | 第105页 |
| 1.2.3 ACLR基因工程菌酶活性测定 | 第105-106页 |
| 1.3 实验结果 | 第106-113页 |
| 1.3.1 重组质粒pET-Duet-aclR构建 | 第106-110页 |
| 1.3.2 己内酰胺酶ACLR工程菌诱导表达 | 第110页 |
| 1.3.3 己内酰胺消旋酶ACLR酶活性测定 | 第110-111页 |
| 1.3.4 酶反应条件的优化 | 第111-113页 |
| 1.4 结论 | 第113-114页 |
| 第二节 双酶法制备L/D-蛋氨酸 | 第114-125页 |
| 2.1 实验材料 | 第115-116页 |
| 2.1.1 菌种 | 第115-116页 |
| 2.1.2 仪器与试剂 | 第116页 |
| 2.2 实验方法 | 第116-117页 |
| 2.2.1 实验路线 | 第116页 |
| 2.2.2 DL-蛋氨酰胺制备 | 第116页 |
| 2.2.3 PepB、DaaA及ACLR菌体培养及收集 | 第116-117页 |
| 2.2.4 L/D型蛋氨酸标准曲线绘制 | 第117页 |
| 2.2.5 酶法转化及酶活测定 | 第117页 |
| 2.3 实验结果 | 第117-124页 |
| 2.3.1 L和D型蛋氨酸标准工作曲线 | 第117页 |
| 2.3.2 反应温度对酶活影响 | 第117-118页 |
| 2.3.3 反应pH值对酶活影响 | 第118页 |
| 2.3.4 底物浓度对酶活影响 | 第118-122页 |
| 2.3.5 双酶体系中不同种类酶比例对催化效率影响 | 第122页 |
| 2.3.6 酶促拆分进程 | 第122-124页 |
| 2.3.7 D/L-蛋氨酸制备 | 第124页 |
| 2.4 结论 | 第124-125页 |
| 第三节 双酶法制备D/L-2-氨基脂肪酸 | 第125-127页 |
| 3.1 实验材料 | 第125页 |
| 3.1.1 菌株 | 第125页 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 | 第125页 |
| 3.2 实验方法 | 第125-126页 |
| 3.2.1 实验路线 | 第125-126页 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺化学合成 | 第126页 |
| 3.2.3 酶转化反应 | 第126页 |
| 3.4 实验结果 | 第126-127页 |
| 3.5 结论 | 第127页 |
| 参考文献 | 第127-128页 |
| 第五章 抗癫痫药物拉科酰胺化学酶法合成 | 第128-139页 |
| 2.1 实验材料 | 第129-130页 |
| 2.1.1 菌种 | 第129页 |
| 2.1.2 仪器与试剂 | 第129-130页 |
| 2.2 实验方法 | 第130-133页 |
| 2.2.1 实验路线 | 第130页 |
| 2.2.2 甲醇钠的制备 | 第130页 |
| 2.2.3 2-溴-3-甲氧基丙酸甲酯制备 | 第130-131页 |
| 2.2.4 2-溴-3-甲氧基丙酸制备 | 第131页 |
| 2.2.5 DL-3-甲氧基丙氨酸制备 | 第131页 |
| 2.2.6 DL-3-甲氧基丙氨酸分离 | 第131页 |
| 2.2.7 DL-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸制备 | 第131-132页 |
| 2.2.8 氨基酰化酶固定化细胞制备 | 第132页 |
| 2.2.9 L-3-甲氧基丙氨酸标准曲线绘制 | 第132页 |
| 2.2.10 固定化细胞酶活定义 | 第132页 |
| 2.2.11 L-3-甲氧基丙氨酸、D-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸分离纯化 | 第132页 |
| 2.2.12 拉科酰胺合成 | 第132-133页 |
| 2.3 实验结果 | 第133-137页 |
| 2.3.1 氨解条件 | 第133页 |
| 2.3.2 L-3-甲氧基丙氨酸标准工作曲线 | 第133页 |
| 2.3.3 DL-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸结构表征 | 第133-134页 |
| 2.3.4 转化条件对酶活影响 | 第134页 |
| 2.3.5 L-3-甲氧基丙氨酸结构表征 | 第134-136页 |
| 2.3.6 D-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸结构表征 | 第136页 |
| 2.3.7 拉科酰胺结构表征 | 第136-137页 |
| 2.4 结论 | 第137-138页 |
| 参考文献 | 第138-139页 |
| 总结 | 第139-140页 |
| 攻读博士学位期间发表论文与申请专利 | 第140-142页 |
| 致谢 | 第142-143页 |
