纳豆激酶热稳定性及pH稳定性的改造研究
| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第9-17页 |
| 1.1 枯草杆菌蛋白酶概述 | 第9-10页 |
| 1.1.1 枯草杆菌蛋白酶研究简介 | 第9页 |
| 1.1.2 枯草杆菌蛋白酶的空间结构 | 第9-10页 |
| 1.1.3 枯草杆菌蛋白酶的催化机理 | 第10页 |
| 1.1.4 枯草杆菌蛋白酶的稳定性研究 | 第10页 |
| 1.2 纳豆激酶研究概述 | 第10-14页 |
| 1.2.1 纳豆与纳豆激酶 | 第10-11页 |
| 1.2.2 纳豆激酶的结构 | 第11页 |
| 1.2.3 理化特性 | 第11-12页 |
| 1.2.4 溶栓作用机理 | 第12页 |
| 1.2.5 纳豆激酶活性测定方法 | 第12-13页 |
| 1.2.6 纳豆激酶分子生物学研究 | 第13-14页 |
| 1.2.7 纳豆激酶的开发前景 | 第14页 |
| 1.3 计算机分子动力学模拟 | 第14-15页 |
| 1.4 本课题立题依据及意义 | 第15页 |
| 1.5 本课题主要研究内容 | 第15-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-25页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第17-18页 |
| 2.1.3 主要设备与仪器 | 第18页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第18-19页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第19页 |
| 2.2 纳豆激酶突变库构建 | 第19-22页 |
| 2.2.1 质粒的提取 | 第19页 |
| 2.2.2 定点突变引物设计 | 第19-21页 |
| 2.2.3 全质粒PCR | 第21-22页 |
| 2.2.4 目的片段的纯化 | 第22页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第22页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的转化 | 第22页 |
| 2.3 纳豆激酶的表达纯化 | 第22-23页 |
| 2.3.1 诱导表达 | 第22-23页 |
| 2.3.2 纯化 | 第23页 |
| 2.3.3 蛋白浓度的测定 | 第23页 |
| 2.4 纳豆激酶的酶学性质分析 | 第23-24页 |
| 2.4.1 纳豆激酶酶活的测定 | 第23页 |
| 2.4.2 热稳定性提高突变体初步筛选 | 第23页 |
| 2.4.3 耐酸性突变体初步筛选 | 第23页 |
| 2.4.4 最适温度的测定 | 第23-24页 |
| 2.4.5 最适pH的测定 | 第24页 |
| 2.4.6 热稳定性的测定 | 第24页 |
| 2.4.7 pH稳定性的测定 | 第24页 |
| 2.4.8 动力学常数的测定 | 第24页 |
| 2.5 分子动力学模拟 | 第24-25页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第25-46页 |
| 3.1 纳豆激酶酶活及热稳定性改造 | 第25-30页 |
| 3.1.1 突变体的设计 | 第25-27页 |
| 3.1.2 单突变体的初步筛选 | 第27页 |
| 3.1.3 组合突变与酶学性质表征 | 第27-29页 |
| 3.1.4 动力学常数和比酶活的测定 | 第29-30页 |
| 3.2 纳豆激酶的pH稳定性改造 | 第30-36页 |
| 3.2.1 突变体的设计 | 第30-31页 |
| 3.2.2 突变体的初步筛选 | 第31-32页 |
| 3.2.3 组合突变体酶学性质表征 | 第32-34页 |
| 3.2.4 动力学常数和比酶活的测定 | 第34页 |
| 3.2.5 分子动力学模拟 | 第34-36页 |
| 3.3 纳豆激酶的功能迭代提高 | 第36-40页 |
| 3.3.1 多种组合突变体的构建 | 第36页 |
| 3.3.2 组合突变体酶学性质的表征 | 第36-39页 |
| 3.3.3 动力学常数与比酶活测定 | 第39-40页 |
| 3.4 纳豆激酶的耐酸性机制研究 | 第40-46页 |
| 3.4.1 分子动力学模拟分析 | 第40-41页 |
| 3.4.2 丙氨酸扫描 | 第41-42页 |
| 3.4.3 不同种类氨基酸的改造 | 第42-46页 |
| 主要结论与展望 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第54页 |
