| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-40页 |
| 1.1 细菌质粒的基本特征 | 第13-28页 |
| 1.1.1 质粒的复制方式 | 第13-20页 |
| 1.1.1.1 θ复制及其分类 | 第14-16页 |
| 1.1.1.2 滚环复制及其分类 | 第16-18页 |
| 1.1.1.3 D-环复制 | 第18-20页 |
| 1.1.2 质粒分离的稳定性 | 第20-21页 |
| 1.1.2.1 主动分配系统 | 第20页 |
| 1.1.2.2 质粒沉溺系统 | 第20-21页 |
| 1.1.2.3 位点特异性重组系统 | 第21页 |
| 1.1.3 质粒的不相容性 | 第21-22页 |
| 1.1.4 质粒拷贝数 | 第22页 |
| 1.1.5 质粒拷贝数的控制 | 第22-28页 |
| 1.1.5.1 重复子控制 | 第22-24页 |
| 1.1.5.2 反义RNA控制 | 第24-27页 |
| 1.1.5.3 转录阻遏蛋白和反义RNA共同控制 | 第27-28页 |
| 1.2 测定质粒拷贝数的方法 | 第28-29页 |
| 1.2.1 直接测定法 | 第28-29页 |
| 1.2.1.1 氯化铯-溴化乙锭(CsCl-EB)平衡梯度离心法 | 第28页 |
| 1.2.1.2 凝胶电泳(Gel electrophoresis,GE)法 | 第28页 |
| 1.2.1.3 高效液相色谱(HPLC)法 | 第28-29页 |
| 1.2.2 间接测定法 | 第29页 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR(real-time qPCR)测定质粒的拷贝数 | 第29页 |
| 1.3 实时荧光定量PCR(real-time qPCR)技术 | 第29-34页 |
| 1.3.1 荧光定量PCR的工作原理 | 第30-31页 |
| 1.3.2 荧光化学物质 | 第31-33页 |
| 1.3.2.1 DNA结合染料法 | 第31-32页 |
| 1.3.2.2 水解探针法 | 第32-33页 |
| 1.3.3 数据分析方法 | 第33-34页 |
| 1.3.3.1 绝对定量法 | 第33页 |
| 1.3.3.2 相对定量法 | 第33-34页 |
| 1.3.4 实时荧光定量PCR的特点 | 第34页 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌的研究进展 | 第34-38页 |
| 1.4.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类 | 第35页 |
| 1.4.2 苏云金芽胞杆菌质粒的功能 | 第35-37页 |
| 1.4.2.1 携带杀虫晶体蛋白基因及其辅助蛋白基因 | 第35-36页 |
| 1.4.2.2 接合转移 | 第36-37页 |
| 1.4.2.3 携带转座因子 | 第37页 |
| 1.4.2.4 其它功能 | 第37页 |
| 1.4.3 苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520简介 | 第37-38页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第38-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-49页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-43页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第40-42页 |
| 2.1.2 培养基 | 第42页 |
| 2.1.3 细菌用抗生素及其培养温度 | 第42-43页 |
| 2.1.4 试剂、耗材和仪器 | 第43页 |
| 2.1.4.1 试剂和耗材 | 第43页 |
| 2.1.4.2 仪器 | 第43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-49页 |
| 2.2.1 DNA操作 | 第43-45页 |
| 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌总DNA的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的制备 | 第44页 |
| 2.2.1.3 质粒DNA的纯化 | 第44页 |
| 2.2.1.4 DNA的体外重组操作 | 第44-45页 |
| 2.2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 | 第45页 |
| 2.2.2.1 大肠杆菌CaCl2感受态的制备及转化 | 第45页 |
| 2.2.2.2 大肠杆菌转化子的筛选 | 第45页 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌芽胞的制备 | 第45页 |
| 2.2.4 苏云金芽胞杆菌显微镜观察 | 第45页 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌YBT-1520生长状态的检测 | 第45-46页 |
| 2.2.6 PCR反应 | 第46-48页 |
| 2.2.6.1 引物的设计与合成 | 第46页 |
| 2.2.6.2 常规PCR扩增 | 第46-48页 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR反应条件的优化 | 第48-49页 |
| 2.2.7.1 Mg~(2+)浓度的优化 | 第48页 |
| 2.2.7.2 引物浓度的优化 | 第48页 |
| 2.2.7.3 建立标准曲线 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-88页 |
| 3.1 实时荧光定量PCR测定质粒拷贝数技术平台的建立 | 第49-72页 |
| 3.1.1 实时荧光定量PCR靶基因的选取 | 第49-51页 |
| 3.1.2 质粒标准品载体的构建 | 第51-52页 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR反应条件的优化 | 第52-55页 |
| 3.1.4.1 Mg~(2+)浓度的优化 | 第53-54页 |
| 3.1.4.2 引物浓度的优化 | 第54-55页 |
| 3.1.4.3 总DNA模板的优化 | 第55页 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR反应体系的评价 | 第55-71页 |
| 3.1.6 以质粒上不同位点的片段作为real-time qPCR检测的靶片段对测定质粒拷贝数的影响 | 第71页 |
| 3.1.7 小结 | 第71-72页 |
| 3.2 菌株YBT-1520在对数生长中期(OD_(600)=2.0)时质粒生物量的分析 | 第72-75页 |
| 3.2.1 菌株YBT-1520在对数生长中期(OD_(600)=2.0)时11个质粒的拷贝数 | 第72页 |
| 3.2.2 质粒的拷贝数与分子量呈负相关 | 第72-74页 |
| 3.2.3 质粒的生物量与分子量无相关性 | 第74页 |
| 3.2.4 菌株YBT-1520在对数生长中期(OD_(600)=2.0)时的生物总量 | 第74-75页 |
| 3.2.5 小结 | 第75页 |
| 3.3 菌株YBT-1520生长至芽胞期时质粒生物量的分析 | 第75-79页 |
| 3.3.1 pBMB2062、pBMB67和pBMB293在菌株YBT-1520整个生长周期拷贝数的变化 | 第75-76页 |
| 3.3.2 质粒在对数生长中期和芽胞期拷贝数的比值与分子量之间的关系 | 第76-79页 |
| 3.3.3 YBT-1520菌株生长至芽胞期时质粒的生物总量 | 第79页 |
| 3.3.4 小结 | 第79页 |
| 3.4 pBMB2062在3个不同的宿主中的拷贝数 | 第79-82页 |
| 3.4.1 pBMB2062在不同宿主中的序列分析 | 第79-81页 |
| 3.4.2 pBMB2062在不同宿主中拷贝数的变化 | 第81-82页 |
| 3.5 菌株YBT-1520中11个质粒所携带的基因生物信息学分析 | 第82-88页 |
| 3.5.1 GO注释 | 第82-84页 |
| 3.5.2 GO分类 | 第84-88页 |
| 3.5.2.1 细胞组份 | 第84-85页 |
| 3.5.2.2 细胞生长 | 第85页 |
| 3.5.2.3 基因交流 | 第85-88页 |
| 4 讨论 | 第88-90页 |
| 5 总结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 附录A 本研究所用工具载体的物理图谱 | 第104-105页 |
| 附录B 发表论文 | 第105页 |
