| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-27页 |
| 第一章 含硫化合物及其代谢物在生命体中的功能 | 第14-17页 |
| 1 含硫化合物 | 第14页 |
| 2 抗氧化胁迫 | 第14-15页 |
| 3 清除重金属 | 第15页 |
| 4 抗病虫害 | 第15-17页 |
| 第二章 硫代谢相关酶 | 第17-25页 |
| 1 硫转运蛋白家族 | 第17-19页 |
| 2 ATP硫酸化酶 | 第19-20页 |
| 3 APS还原酶 | 第20-22页 |
| 4 APS激酶 | 第22-24页 |
| 5 亚硫酸盐还原酶(SIR) | 第24-25页 |
| 第三章 本课题的研究目的及意义 | 第25-27页 |
| 技术路线 | 第26-27页 |
| 第二部分 研究内容 | 第27-70页 |
| 第一章 嗜热菌SAC的构建表达与活性测定 | 第27-47页 |
| 1 前言 | 第27-28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-39页 |
| 2.1 酶与生化试剂 | 第28页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第28页 |
| 2.3 方法 | 第28-39页 |
| 2.3.1 质粒提取 | 第28-29页 |
| 2.3.2 双酶切载体(pSKB4)及质粒(pUC57-Simple-tfsac) | 第29-30页 |
| 2.3.3 割胶回收 | 第30页 |
| 2.3.4 构建重组质粒pSKB4-tfsac | 第30-31页 |
| 2.3.5 感受态的制备 | 第31页 |
| 2.3.6 连接产物pSKB4-TFSAC的转化 | 第31-32页 |
| 2.3.7 嗜热菌SAC诱导表达 | 第32页 |
| 2.3.8 透析袋预处理 | 第32页 |
| 2.3.9 嗜热菌SAC蛋白的纯化 | 第32-34页 |
| 2.3.10 蛋白电泳检测 | 第34页 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 | 第34-36页 |
| 2.3.12 嗜热菌SAC蛋白酶活性测定 | 第36-37页 |
| 2.3.13 温度对球形红细菌SAC(rsSAC)和嗜热菌SAC(tfSAC)APSK活性的影响 | 第37页 |
| 2.3.14 嗜热菌SAC的室温下稳定性测定 | 第37页 |
| 2.3.15 tfSAC ATPS结构域的突变改造 | 第37-38页 |
| 2.3.16 TFSACHL纯化及活性测定 | 第38-39页 |
| 3 实验结果 | 第39-45页 |
| 3.1 表达载体 pSKB4、pSKB4△GST 与 pUC57-Simple-tfsac双酶切 | 第39页 |
| 3.2 pSKB4-tfsac与pSKB4△GST-tfsac的酶切验证 | 第39-40页 |
| 3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的诱导表达及纯化 | 第40-41页 |
| 3.4 蛋白定量 | 第41-42页 |
| 3.5 tfSAC酶活性测定 | 第42页 |
| 3.6 温度对rsSAC和tfSAC APSK活性的影响 | 第42-43页 |
| 3.7 室温下tfSAC的APSK稳定性测定 | 第43-44页 |
| 3.8 tfSAC的突变改造 | 第44页 |
| 3.9 tfSACHL纯化 | 第44页 |
| 3.10 tfSACHL活性测定 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-47页 |
| 第二章 球形红细菌硫酸盐活化酶复合体突变蛋白的通道分析 | 第47-55页 |
| 1 前言 | 第47页 |
| 2 材料与方法 | 第47-50页 |
| 2.1 酶与生化试剂 | 第47页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第47页 |
| 2.3 球形红细菌SAC突变体的构建 | 第47-49页 |
| 2.3.1 突变体的确定以及设计突变引物 | 第47-48页 |
| 2.3.2 PCR定点突变 | 第48-49页 |
| 2.3.3 PCR产物的处理与纯化 | 第49页 |
| 2.4 质粒提取与转化 | 第49页 |
| 2.5 蛋白的表达与纯化 | 第49页 |
| 2.6 SDS-聚丙烯凝胶电泳检测及蛋白质浓度测定 | 第49-50页 |
| 2.7 突变蛋白活性测定 | 第50页 |
| 3 实验结果 | 第50-54页 |
| 3.1 突变位点的选择与引物设计 | 第50页 |
| 3.2 PCR结果检测及酶切验证 | 第50-53页 |
| 3.2.1 SA214E构建 | 第50-51页 |
| 3.2.2 37DRY构建 | 第51-52页 |
| 3.2.3 分子设计最小的通道结构单元 | 第52-53页 |
| 3.3 突变蛋白活性测定 | 第53-54页 |
| 3.3.1 SA214A活性测定 | 第53页 |
| 3.3.2 SACMONO-APSK经过活性测定 | 第53-54页 |
| 3.3.3 37DRY活性测定 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第三章 大肠杆菌APS激酶磷酸化APS的机制 | 第55-60页 |
| 1 前言 | 第55页 |
| 2 材料与方法 | 第55-57页 |
| 2.1 Western blot所使用的抗体与试剂 | 第55-56页 |
| 2.2 纯化菌株与蛋白表达载体 | 第56页 |
| 2.3 大肠杆菌APSK氨基酸定点突变 | 第56页 |
| 2.3.1 氨基酸位点的选择 | 第56页 |
| 2.3.2 定点突变的方法同第一章 | 第56页 |
| 2.4 蛋白的表达与纯化、浓度测定及酶活性测定 | 第56页 |
| 2.5 Western杂交分析 | 第56-57页 |
| 2.5.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第56页 |
| 2.5.2 转膜 | 第56-57页 |
| 2.5.3 封闭 | 第57页 |
| 2.5.4 一抗孵育 | 第57页 |
| 2.5.5 二抗孵育 | 第57页 |
| 2.5.6 显色反应 | 第57页 |
| 3 实验结果 | 第57-59页 |
| 3.1 突变位点的选择与突变引物设计 | 第57-58页 |
| 3.2 大肠杆菌APSK突变蛋白活性测定 | 第58-59页 |
| 3.3 Western blot检测突变蛋白磷酸化 | 第59页 |
| 4 讨论 | 第59-60页 |
| 第四章 活性测定相关酶的纯化及活性测定 | 第60-70页 |
| 1 前言 | 第60-61页 |
| 2 材料与方法 | 第61-64页 |
| 2.1 菌株与载体 | 第61页 |
| 2.2 酶与生化试剂 | 第61页 |
| 2.3 方法 | 第61-64页 |
| 2.3.1 大肠杆菌PKII基因克隆及蛋白表达、纯化 | 第61-62页 |
| 2.3.2 球形红细菌SAC突变体的构建、表达纯化 | 第62页 |
| 2.3.3 PK活性测定 | 第62-63页 |
| 2.3.4 PKII活性的影响因素 | 第63页 |
| 2.3.5 SAC及其突变体的活性测定 | 第63-64页 |
| 3 结果 | 第64-68页 |
| 3.1 大肠杆菌PKII基因的克隆及蛋白表达纯化 | 第64-65页 |
| 3.2 酶活性测定 | 第65页 |
| 3.3 pH、温度以及低温保存对酶活影响 | 第65-66页 |
| 3.5 不同丙酮酸激酶的动力学常数比较 | 第66-67页 |
| 3.6 PKII作为偶联酶的应用 | 第67-68页 |
| 4 讨论与展望 | 第68-70页 |
| 结论与展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-82页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
