| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 符号说明 | 第23-26页 |
| 第一章 文献综述 | 第26-52页 |
| 1.1 真菌免疫调节蛋白 | 第26-40页 |
| 1.1.1 真菌免疫调节蛋白的生物学特性 | 第27-31页 |
| 1.1.1.1 基本组分组成特征 | 第27-28页 |
| 1.1.1.2 真菌免疫调节蛋白结构特征 | 第28-30页 |
| 1.1.1.3 真菌免疫调节蛋白的多样性 | 第30-31页 |
| 1.1.2 真菌免疫调节蛋白的分子生物学研究 | 第31-34页 |
| 1.1.2.1 真菌免疫调节蛋白基因克隆 | 第31-33页 |
| 1.1.2.2 真菌免疫调节蛋白基因的表达 | 第33-34页 |
| 1.1.3 真菌免疫调节蛋白生物学功能 | 第34-39页 |
| 1.1.3.1 血细胞凝集反应 | 第34页 |
| 1.1.3.2 抗过敏活性 | 第34-35页 |
| 1.1.3.3 抗肿瘤活性 | 第35-37页 |
| 1.1.3.4 促进淋巴细胞增殖 | 第37页 |
| 1.1.3.5 刺激免疫细胞产生多种细胞因子 | 第37-39页 |
| 1.1.4 前景与展望 | 第39-40页 |
| 1.1.4.1 健康产品 | 第39页 |
| 1.1.4.2 抗排异反应药物 | 第39-40页 |
| 1.2 DNA 改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用 | 第40-49页 |
| 1.2.1 DNA 改组技术 | 第41-44页 |
| 1.2.1.1 单基因或DNA 片段的改组 | 第42-43页 |
| 1.2.1.2 基因组或染色体的改组 | 第43页 |
| 1.2.1.3 与其他技术相结合的改组 | 第43-44页 |
| 1.2.2 基因突变体文库的筛选 | 第44-45页 |
| 1.2.2.1 琼脂板涂布法 | 第44页 |
| 1.2.2.2 噬菌体展示技术 | 第44页 |
| 1.2.2.3 细胞表面展示技术 | 第44-45页 |
| 1.2.2.4 核糖体展示技术和mRNA 展示技术 | 第45页 |
| 1.2.3 DNA 改组技术在蛋白类药物上的应用 | 第45-49页 |
| 1.2.3.1 细胞因子 | 第45-46页 |
| 1.2.3.2 酶类药物 | 第46-48页 |
| 1.2.3.3 抗体 | 第48页 |
| 1.2.3.4 疫苗 | 第48-49页 |
| 1.3 展望 | 第49-50页 |
| 1.4 本论文研究目的 | 第50-52页 |
| 第二章 真菌免疫调节蛋白的原核表达、生物学活性检测及多克隆抗体制备 | 第52-97页 |
| 2.1 材料 | 第52页 |
| 2.2 试剂与培养基 | 第52-56页 |
| 2.2.1 试剂盒 | 第53页 |
| 2.2.2 相关试剂 | 第53页 |
| 2.2.3 其他试剂 | 第53-55页 |
| 2.2.4 培养基 | 第55-56页 |
| 2.3 主要仪器和设备 | 第56-57页 |
| 2.4 实验方法 | 第57-74页 |
| 2.4.1 真菌免疫调节蛋白基因克隆 | 第57-59页 |
| 2.4.1.1 基因组DNA 提取 | 第57-58页 |
| 2.4.1.2 真菌免疫调节蛋白基因克隆 | 第58-59页 |
| 2.4.2 克隆载体构建 | 第59-61页 |
| 2.4.2.1 目的基因纯化 | 第59页 |
| 2.4.2.2 目的基因与克隆载体连接 | 第59-60页 |
| 2.4.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第60页 |
| 2.4.2.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第60页 |
| 2.4.2.5 菌落PCR 检测 | 第60-61页 |
| 2.4.2.6 测序 | 第61页 |
| 2.4.3 原核表达载体构建 | 第61-64页 |
| 2.4.3.1 质粒提取 | 第62页 |
| 2.4.3.2 质粒酶切 | 第62-63页 |
| 2.4.3.3 目的基因纯化 | 第63页 |
| 2.4.3.4 目的基因片段与表达载体连接 | 第63页 |
| 2.4.3.5 连接产物转入大肠杆菌M15 感受态细胞 | 第63-64页 |
| 2.4.3.6 菌落PCR 检测 | 第64页 |
| 2.4.3.7 测序 | 第64页 |
| 2.4.4 重组真菌免疫调节蛋白诱导表达 | 第64-68页 |
| 2.4.4.1 SDS-PAGE 凝胶配制 | 第64-65页 |
| 2.4.4.2 IPTG 诱导表达 | 第65-66页 |
| 2.4.4.3 时间梯度诱导及Western Blot 检测 | 第66页 |
| 2.4.4.4 原核表达产物的可溶性分析 | 第66-67页 |
| 2.4.4.5 表达产物的纯化 | 第67页 |
| 2.4.4.6 重组真菌免疫调节蛋白 MALDI-MS 分析 | 第67-68页 |
| 2.4.5 重组真菌免疫调节蛋白浓度测定 | 第68页 |
| 2.4.5.1 标准曲线绘制 | 第68页 |
| 2.4.5.2 样品浓度测定 | 第68页 |
| 2.4.6 重组真菌免疫调节蛋白多克隆抗体制备 | 第68-70页 |
| 2.4.6.1 免疫过程 | 第68-69页 |
| 2.4.6.2 抗血清中抗体效价的检测 | 第69页 |
| 2.4.6.3 免疫前血清背景检测 | 第69-70页 |
| 2.4.6.4 免疫后血清效价测定 | 第70页 |
| 2.4.6.5 抗血清中抗体Western Blot 检测 | 第70页 |
| 2.4.7 真菌免疫调节蛋白诱导产生细胞因子 | 第70-74页 |
| 2.4.7.1 细胞培养 | 第70-71页 |
| 2.4.7.2 提取所培养细胞RNA | 第71-72页 |
| 2.4.7.3 RT-PCR 检测 | 第72-74页 |
| 2.5 结果 | 第74-94页 |
| 2.5.1 真菌免疫调节蛋白基因克隆 | 第74-76页 |
| 2.5.1.1 真菌免疫调节蛋白基因琼脂糖凝胶电泳 | 第74-75页 |
| 2.5.1.2 真菌免疫调节蛋白基因测序 | 第75-76页 |
| 2.5.2 原核表达载体构建 | 第76-80页 |
| 2.5.2.1 质粒双酶切 | 第76-79页 |
| 2.5.2.2 重组质粒测序 | 第79-80页 |
| 2.5.3 重组真菌免疫调节蛋白诱导表达 | 第80-87页 |
| 2.5.3.1 原核表达产物的SDS-PAGE 电泳鉴定 | 第80-81页 |
| 2.5.3.2 原核表达产物时间梯度的SDS-PAGE 及Western Blot 鉴定 | 第81-83页 |
| 2.5.3.3 重组真菌免疫调节蛋白纯化 | 第83-85页 |
| 2.5.3.5 重组真菌免疫调节蛋白 MALDI-MS 分析 | 第85-87页 |
| 2.5.4 重组真菌免疫调节蛋白浓度测定 | 第87-89页 |
| 2.5.5 重组真菌免疫调节蛋白多克隆抗体制备 | 第89-91页 |
| 2.5.5.1 抗血清中抗体效价的检测 | 第89-91页 |
| 2.5.5.2 多克隆抗体Western Blot 检测 | 第91页 |
| 2.5.6 重组真菌免疫调节蛋白诱导细胞因子 | 第91-94页 |
| 2.6 讨论 | 第94-97页 |
| 第三章 真菌免疫调节蛋白基因改组初探 | 第97-116页 |
| 3.1 材料 | 第97页 |
| 3.2 试剂与培养基 | 第97-99页 |
| 3.2.1 试剂盒 | 第97页 |
| 3.2.2 相关试剂 | 第97-98页 |
| 3.2.3 其他试剂 | 第98页 |
| 3.2.4 培养基 | 第98-99页 |
| 3.3 主要仪器和设备 | 第99页 |
| 3.4 实验方法 | 第99-108页 |
| 3.4.1 真菌免疫调节蛋白基因重组 | 第99-104页 |
| 3.4.1.1 真菌免疫调节蛋白基因片段合成 | 第99-101页 |
| 3.4.1.2 无引物PCR | 第101-102页 |
| 3.4.1.3 无引物PCR 产物回收 | 第102页 |
| 3.4.1.4 有引物PCR | 第102-104页 |
| 3.4.1.5 有引物PCR 产物回收 | 第104页 |
| 3.4.2 表达载体构建 | 第104-108页 |
| 3.4.2.1 质粒提取 | 第104-105页 |
| 3.4.2.2 双酶切 | 第105页 |
| 3.4.2.3 酶切产物回收 | 第105-106页 |
| 3.4.2.4 目的基因与表达载体连接 | 第106页 |
| 3.4.2.5 大肠杆菌M15 感受态细胞的制作 | 第106-107页 |
| 3.4.2.6 重组表达载体转化大肠杆菌M15 感受态细胞 | 第107页 |
| 3.4.2.7 菌落PCR 检测 | 第107页 |
| 3.4.2.8 测序 | 第107-108页 |
| 3.5 结果 | 第108-114页 |
| 3.5.1 真菌免疫调节蛋白基因重组 | 第108-114页 |
| 3.5.1.1 真菌免疫调节蛋白基因合成 | 第108-109页 |
| 3.5.1.2 测序 | 第109-114页 |
| 3.6 讨论 | 第114-116页 |
| 第四章 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子克隆 | 第116-141页 |
| 4.1 材料 | 第116-117页 |
| 4.2 试剂及培养基 | 第117-120页 |
| 4.2.1 试剂盒 | 第117页 |
| 4.2.2 相关试剂 | 第117页 |
| 4.2.3 其他试剂 | 第117-118页 |
| 4.2.4 培养基 | 第118-120页 |
| 4.3 主要仪器和设备 | 第120页 |
| 4.4 实验方法 | 第120-134页 |
| 4.4.1 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆 | 第120-126页 |
| 4.4.1.1 提取金针菇基因组DNA | 第121页 |
| 4.4.1.2 金针菇基因组DNA 的酶切 | 第121-122页 |
| 4.4.1.3 DNA 酶切产物的回收 | 第122页 |
| 4.4.1.4 连接反应 | 第122-123页 |
| 4.4.1.5 PCR 扩增 | 第123-124页 |
| 4.4.1.6 胶回收 | 第124页 |
| 4.4.1.7 目的基因与克隆载体连接 | 第124页 |
| 4.4.1.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第124-125页 |
| 4.4.1.9 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第125页 |
| 4.4.1.10 菌落PCR 检测 | 第125-126页 |
| 4.4.1.11 测序 | 第126页 |
| 4.4.2 植物表达载体的构建 | 第126-131页 |
| 4.4.2.1 引入酶切位点 | 第127-128页 |
| 4.4.2.2 目的基因纯化 | 第128页 |
| 4.4.2.3 目的基因与克隆载体连接 | 第128页 |
| 4.4.2.4 连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第128页 |
| 4.4.2.5 菌落PCR 检测 | 第128页 |
| 4.4.2.6 质粒抽提 | 第128-129页 |
| 4.4.2.7 质粒双酶切 | 第129页 |
| 4.4.2.8 目的基因纯化 | 第129-130页 |
| 4.4.2.9 目的基因与植物表达载体连接 | 第130页 |
| 4.4.2.10 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第130页 |
| 4.4.2.11 菌落PCR 检测 | 第130页 |
| 4.4.2.12 测序 | 第130页 |
| 4.4.2.13 质粒抽提 | 第130页 |
| 4.4.2.14 根癌农杆菌EHA 105 感受态细胞的制备 | 第130-131页 |
| 4.4.2.15 根癌农杆菌转化子的获得 | 第131页 |
| 4.4.2.16 根癌农杆菌转化子的PCR 检测 | 第131页 |
| 4.4.3 烟草转化 | 第131-133页 |
| 4.4.3.1 烟草无菌苗的获得 | 第131页 |
| 4.4.3.2 烟草转化 | 第131-132页 |
| 4.4.3.3 烟草DNA 的提取 | 第132-133页 |
| 4.4.3.4 转基因烟草的PCR 检测 | 第133页 |
| 4.4.4 启动子功能的检测 | 第133-134页 |
| 4.4.4.1 GUS 检测 | 第133页 |
| 4.4.4.2 荧光检测 | 第133-134页 |
| 4.5 实验结果 | 第134-139页 |
| 4.5.1 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆 | 第134-137页 |
| 4.5.1.1 金针菇基因组DNA 酶切 | 第134-135页 |
| 4.5.1.2 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆 | 第135页 |
| 4.5.1.3 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子序列分析 | 第135-137页 |
| 4.5.2 转基因烟草的检测 | 第137页 |
| 4.5.3 启动子功能检测 | 第137-139页 |
| 4.5.3.1 GUS 染色检测 | 第137-138页 |
| 4.5.3.2 荧光检测 | 第138-139页 |
| 4.6 讨论 | 第139-141页 |
| 第五章 总结与展望 | 第141-145页 |
| 5.1 研究总结 | 第141-142页 |
| 5.1.1 真菌免疫调节蛋白原核表达、生物学活性检测及多克隆抗体制备 | 第141-142页 |
| 5.1.2 真菌免疫调节蛋白基因改组初探 | 第142页 |
| 5.1.3 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆 | 第142页 |
| 5.2 创新点 | 第142-143页 |
| 5.3 研究展望 | 第143-145页 |
| 5.3.1 真菌免疫调节蛋白原核表达、生物学活性检测及多克隆抗体制备 | 第143页 |
| 5.3.2 真菌免疫调节蛋白基因改组初探 | 第143-144页 |
| 5.3.3 金针菇真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆 | 第144-145页 |
| 参考文献 | 第145-156页 |
| 致谢 | 第156-158页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及申请的专利目录 | 第158-163页 |
| 上海交通大学硕士学位论文答辩决议书 | 第163页 |
