| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-27页 |
| 1.1 手性环氧化物及其产物邻二醇 | 第12-14页 |
| 1.1.1 手性环氧化物简介 | 第12-13页 |
| 1.1.2 手性环氧化物及邻位二醇的合成 | 第13-14页 |
| 1.1.2.1 化学法 | 第13页 |
| 1.1.2.2 生物法 | 第13-14页 |
| 1.2 环氧水解酶 | 第14-26页 |
| 1.2.1 环氧水解酶的结构特点与催化机制 | 第14-17页 |
| 1.2.2 立体选择性 | 第17-18页 |
| 1.2.3 环氧水解酶的应用研究进展 | 第18-26页 |
| 1.2.3.1 环氧水解酶作为抑制剂靶点 | 第18-19页 |
| 1.2.3.2 环氧水解酶作为生物催化剂 | 第19-24页 |
| 1.2.3.3 环氧水解酶在两水相体系中的应用 | 第24-25页 |
| 1.2.3.4 环氧水解酶的改造 | 第25-26页 |
| 1.3 本课题目的与意义 | 第26-27页 |
| 第2章 环氧水解酶基因的克隆 | 第27-43页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第27-33页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1.1 材料与试剂 | 第27页 |
| 2.2.1.2 实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.1.3 质粒与菌株 | 第28页 |
| 2.2.1.4 引物设计 | 第28-29页 |
| 2.2.1.5 微生物培养基和药品配制 | 第29页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第29-33页 |
| 2.2.2.1 改良Trizol法抽提RNA | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 反转录获取CDNA | 第30页 |
| 2.2.2.3 RACE反应 | 第30-31页 |
| 2.2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第31页 |
| 2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.2.6 PCR产物纯化 | 第32页 |
| 2.2.2.7 连接和转化 | 第32-33页 |
| 2.2.2.8 克隆测定与测序 | 第33页 |
| 2.2.2.9 菌种保藏 | 第33页 |
| 2.2.2.10 全长序列的获取 | 第33页 |
| 2.2.2.11 vreh2序列分析 | 第33页 |
| 2.2.2.12 三维结构及活性中心预测 | 第33页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第33-41页 |
| 2.3.1 RNA提取结果 | 第33-34页 |
| 2.3.2 RACE结果 | 第34页 |
| 2.3.3 环氧水解酶全长序列的获得 | 第34-35页 |
| 2.3.4 序列分析结果 | 第35-40页 |
| 2.3.5 三维结构及活性中心预测 | 第40-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-43页 |
| 第3章 环氧水解酶的重组表达与优化 | 第43-53页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料 | 第43-45页 |
| 3.2.1 实验器材 | 第43页 |
| 3.2.2 药品的配制 | 第43-44页 |
| 3.2.3 培养基与菌株和载体 | 第44页 |
| 3.2.4 引物设计 | 第44-45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.3.1 重组菌的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.2 环氧水解酶的初步表达 | 第46-47页 |
| 3.3.3 环氧水解酶表达条件的优化 | 第47页 |
| 3.3.3.1 不同浓度IPTG对蛋白表达的影响 | 第47页 |
| 3.3.3.2 不同破碎液pH对可溶性的影响 | 第47页 |
| 3.3.3.3 不同载体和宿主对可溶性表达的影响 | 第47页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第47-52页 |
| 3.4.1 重组表达质粒的构建 | 第48-49页 |
| 3.4.2 重组环氧水解酶的初步表达 | 第49-50页 |
| 3.4.3 环氧水解酶VrEH2的表达优化 | 第50-52页 |
| 3.4.3.1 不同IPTG浓度对可溶性表达的影响 | 第50-51页 |
| 3.4.3.2 不同载体和宿主对可溶性表达的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.3.3 不同pH值破碎液对蛋白可溶性的影响 | 第52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第4章 环氧水解酶的酶学性质表征 | 第53-66页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 实验仪器与材料 | 第53-54页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第53-54页 |
| 4.2.2 溶液和药品的配制 | 第54页 |
| 4.2.2.1 流动相配制 | 第54页 |
| 4.2.2.2 缓冲液配制 | 第54页 |
| 4.2.2.3 主要试剂 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-57页 |
| 4.3.1 底物pNSO的合成及消旋底物的拆分 | 第54-55页 |
| 4.3.2 环氧水解酶酶活的测定与蛋白纯化 | 第55-56页 |
| 4.3.2.1 酶活测定方法的建立 | 第55页 |
| 4.3.2.2 蛋白纯化 | 第55-56页 |
| 4.3.2.3 蛋白浓度测定 | 第56页 |
| 4.3.2.4 酶活测定 | 第56页 |
| 4.3.3 不同pH对酶活性的影响 | 第56页 |
| 4.3.4 不同温度对酶活性的影响 | 第56-57页 |
| 4.3.5 不同化学试剂对酶的活性影响 | 第57页 |
| 4.3.6 有机溶剂对酶活力的影响 | 第57页 |
| 4.3.7 动力学常数的测定 | 第57页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第57-64页 |
| 4.4.1 pNSO的合成及色谱法拆分 | 第58页 |
| 4.4.2 蛋白纯化 | 第58-59页 |
| 4.4.3 酶活测定 | 第59页 |
| 4.4.4 不同pH缓冲液对酶活性的影响 | 第59-60页 |
| 4.4.5 不同温度对酶活性的影响及温度稳定性 | 第60-62页 |
| 4.4.6 不同化学试剂对酶活性的影响 | 第62-63页 |
| 4.4.7 有机溶剂对环氧水解酶活力的影响 | 第63页 |
| 4.4.8 酶的动力学常数 | 第63-64页 |
| 4.5 本章小结 | 第64-66页 |
| 第5章 环氧水解酶的位置选择性和底物谱 | 第66-72页 |
| 5.1 前言 | 第66页 |
| 5.2 材料 | 第66页 |
| 5.2.1 底物 | 第66页 |
| 5.2.2 材料 | 第66页 |
| 5.3 实验方法 | 第66-67页 |
| 5.3.1 VrEH1和VrEH2对pNSO的立体选择性 | 第66页 |
| 5.3.2 VrEH2底物谱 | 第66-67页 |
| 5.3.2.1 标准曲线的建立 | 第66-67页 |
| 5.3.2.2 VrEH对各种底物的活力和对映归一性 | 第67页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第67-71页 |
| 5.4.1 重组环氧水解VrEH1和VrEH2立体选择性差异 | 第68页 |
| 5.4.2 标准曲线的建立 | 第68-69页 |
| 5.4.3 VrEH2对各种底物的活力和对映归一性 | 第69-71页 |
| 5.5 本章小结 | 第71-72页 |
| 全文总结与展望 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
