| ABSTRACT | 第9-14页 |
| 摘要 | 第15-19页 |
| Abbreviations used in this dissertation | 第19-20页 |
| 1 INTRODUCTION | 第20-25页 |
| 1.1 Pig development in China | 第20-23页 |
| 1.2 Rotavirus associated disease in pigs | 第23-25页 |
| 2 REVIEW OF LITERATURE | 第25-62页 |
| 2.1 History and discovery of rotavirus | 第25-26页 |
| 2.2 Rotavirus etiological characteristics | 第26-33页 |
| 2.2.1 Rotavirus classification | 第26-29页 |
| 2.2.2 Rotavirus genome | 第29-30页 |
| 2.2.3 Rotavirus structure | 第30-32页 |
| 2.2.4 Rotavirus culture characteristics | 第32-33页 |
| 2.3 Rotavirus epidemiology | 第33-37页 |
| 2.4 Rotavirus pathogenesis | 第37-38页 |
| 2.5 Immunization against rotavirus | 第38-49页 |
| 2.5.1 Live attenuated and inactivated rotavius vaccines | 第38-42页 |
| 2.5.2 Subunit vaccines | 第42-45页 |
| 2.5.3 DNA vaccines | 第45-47页 |
| 2.5.4 Transgenic plant vaccines | 第47-49页 |
| 2.6 Advances in rotavirus immunization mechanism | 第49-52页 |
| 2.6.1 Local intestinal mucosal immune protection mechanisms | 第49-50页 |
| 2.6.2 Humoral immune protection mechanisms | 第50-51页 |
| 2.6.3 Immune protective mechanisms of cell-mediated immunity | 第51-52页 |
| 2.7 Advances in diagnosis of rotavirus infection | 第52-60页 |
| 2.7.1 Clinical diagnosis | 第52页 |
| 2.7.2 Etiological diagnosis | 第52-54页 |
| 2.7.3 Serological diagnosis | 第54-57页 |
| 2.7.4 Molecular techniques | 第57-60页 |
| 2.8 The purpose and significance | 第60-62页 |
| 3 PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST VP6 PROTEIN OF PORCINE ROTAVIRUS | 第62-90页 |
| 3.1 Introduction | 第62-63页 |
| 3.2 Materials and Methods | 第63-83页 |
| 3.2.1 Materials | 第63-68页 |
| 3.2.1.3 Instruments and machinery used in this study | 第64页 |
| 3.2.1.4 Reagents | 第64-67页 |
| 3.2.1.9 Primers | 第67-68页 |
| 3.2.2 Methods | 第68-83页 |
| 3.2.2.1 Propagation of PoRVA | 第68页 |
| 3.2.2.2 RNA extraction and cDNA preparation | 第68-69页 |
| 3.2.2.3 PoRVA VP6 gene amplification | 第69页 |
| 3.2.2.4 Recovery and purification of PCR product | 第69-70页 |
| 3.2.2.5 Ligation of purified VP6 gene with pMD18-T vector | 第70页 |
| 3.2.2.6 Preparation of DH5α competent cells | 第70-71页 |
| 3.2.2.7 Transformation of ligated products | 第71页 |
| 3.2.2.8 Extraction of recombinant plasmid and sequence analysis | 第71页 |
| 3.2.2.9 Construction of prokaryotic expression vector pGEX-KG-VP6 | 第71-73页 |
| 3.2.2.9.1 Digestion of recombinant plasmid pMD 18-T-VP6 | 第71-72页 |
| 3.2.2.9.2 Digestion of pGEX-KG vector | 第72-73页 |
| 3.2.2.9.3 Ligation of VP6 gene with pGEX-KG vector | 第73页 |
| 3.2.2.9.4 Transformation of recombinant plasmid pGEX-KG-VP6 | 第73页 |
| 3.2.2.9.5 Screening and identification of recombinant plasmid pGEX-KG-VP6 | 第73页 |
| 3.2.2.10 Protein expression and SDS-PAGE analysis | 第73-75页 |
| 3.2.2.10.1 VP6 protein expression in E. coli strain JM-105 | 第73-74页 |
| 3.2.2.10.2 SDS-PAGE analysis of the expression product | 第74-75页 |
| 3.2.2.11 Expression, purification, and wetem blot analysis of rVP6 protein | 第75-77页 |
| 3.2.2.11.1 Analysis of soluble expression product | 第75页 |
| 3.2.2.11.2 Protein purification | 第75-76页 |
| 3.2.2.11.3 Western-blot analysis of purified protein | 第76-77页 |
| 3.2.2.11.4 Determination of protein concentration | 第77页 |
| 3.2.2.12 Monoclonal antibodies production | 第77-83页 |
| 3.2.2.12.1 Immunization of Balb/C mice | 第77页 |
| 3.2.2.12.2 Selection of immunized Balb/C mice for cell fusion experiment | 第77页 |
| 3.2.2.12.3 SP2/0 myeloma cells activation | 第77-78页 |
| 3.2.2.12.4 Preparation of cells for the cell fusion experiment | 第78-79页 |
| 3.2.2.12.5 Cell fusion experiment | 第79-80页 |
| 3.2.2.12.6 Indirect ELISA for hybridoma screening | 第80-81页 |
| 3.2.2.12.7 Hybridoma limiting dilution ELISA for hybridoma screening | 第81页 |
| 3.2.2.12.8 Isotyping of monoclonal antibodies | 第81页 |
| 3.2.2.12.9 Western-blot analysis of monoclonal antibodies | 第81-82页 |
| 3.2.2.12.10 Indirect-immunofluorescence analysis of monoclonal antibodies | 第82页 |
| 3.2.2.12.11 Ascites production | 第82页 |
| 3.2.2.12.12 Monoclonal antibodies purification | 第82-83页 |
| 3.2.2.12.13 Ascites titers determination | 第83页 |
| 3.3 Results | 第83-87页 |
| 3.3.1 Cloning, expression, and purification of recombinant VP6 protein | 第83-86页 |
| 3.3.2 Monoclonal antibodies production and purification | 第86-87页 |
| 3.4 Discussion | 第87-90页 |
| 4 DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ANTIGEN-CAPTURE ELISA FOR DETECTION OF PORCINE ROTAVIRUS | 第90-111页 |
| 4.1 Introduction | 第90-92页 |
| 4.2 Materials and Methods | 第92-96页 |
| 4.2.1 Cloning, expression, and purification of recombinant VP6 | 第92页 |
| 4.2.2 Polyclonal antibody production | 第92页 |
| 4.2.3 Monoclonal antibody production and purification | 第92-95页 |
| 4.2.5 Pab based AC-ELISA development | 第95页 |
| 4.2.6 Validation of AC-ELISA | 第95-96页 |
| 4.3 Results | 第96-106页 |
| 4.3.1 Polyclonal and monoclonal antibody production and purification | 第96-98页 |
| 4.3.2 AC-ELISA development | 第98-101页 |
| 4.3.3 Analytical specificity | 第101页 |
| 4.3.4 Analytical sensitivity of the AC-ELISA | 第101-102页 |
| 4.3.5 Validation of AC-ELISA | 第102-106页 |
| 4.4 Discussion | 第106-111页 |
| 5 MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF PoRVA-VP7 IN CHINA | 第111-123页 |
| 5.1 Introduction | 第111-112页 |
| 5.2 Materials and Methods | 第112-113页 |
| 5.2.1 Clinical samples collection and preparation | 第112页 |
| 5.2.2 RT-PCR and sequencing | 第112-113页 |
| 5.2.3 Phylogenetic and phylogeographic analysis of VP7 | 第113页 |
| 5.2.4 Nucleotide sequence accession numbers | 第113页 |
| 5.3 Results | 第113-119页 |
| 5.3.1 Clinical detection of PoRVA | 第113-114页 |
| 5.3.2 Sequencing results and phylogenetic analysis of partial VP7 encoding genes of pig RVA in China | 第114-119页 |
| 5.4 Discussion | 第119-123页 |
| CONCLUSION | 第123-124页 |
| REFERENCES | 第124-150页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第150-152页 |
