人骨形态蛋白2在毕赤酵母中的表达和生物活性测定
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第11-27页 |
| 1.1 现代生物技术简介 | 第11页 |
| 1.2 基因工程药物 | 第11-12页 |
| 1.3 BMPs的发现 | 第12-15页 |
| 1.3.1 BMP2的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.3.2 BMP2的结构与性质 | 第13页 |
| 1.3.3 BMP2的作用 | 第13-15页 |
| 1.4 BMPs受体的信号转导 | 第15-19页 |
| 1.4.1 BMPs信号拮抗剂 | 第15页 |
| 1.4.2 BMPs受体 | 第15-16页 |
| 1.4.3 BMP受体结合蛋白 | 第16-17页 |
| 1.4.4 Smad家族 | 第17页 |
| 1.4.5 Smad信号通路 | 第17-18页 |
| 1.4.6 TAB 1/TAK1通路 | 第18页 |
| 1.4.7 Ras/MAPK/AP1通路 | 第18-19页 |
| 1.4.8 JAK-STAT通路 | 第19页 |
| 1.4.9 Ca~(2+)/钙调蛋白通路 | 第19页 |
| 1.5 毕赤酵母的研究进展 | 第19-25页 |
| 1.5.1 毕赤酵母表达系统的特性 | 第19-20页 |
| 1.5.2 异源蛋白的分泌表达 | 第20-21页 |
| 1.5.3 常见表达菌株 | 第21-22页 |
| 1.5.4 毕赤酵母表达载体 | 第22-24页 |
| 1.5.5 转化毕赤酵母的方式 | 第24-25页 |
| 1.5.6 外源蛋白的表达 | 第25页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第25-27页 |
| 第二章 表达分子的构建及菌株的筛选 | 第27-51页 |
| 2.1 前言 | 第27页 |
| 2.2 实验仪器和材料 | 第27-30页 |
| 2.2.1 主要仪器和设备 | 第27-28页 |
| 2.2.2 实验材料 | 第28-30页 |
| 2.3 实验验方法 | 第30-41页 |
| 2.3.1 表达载体的分析 | 第30-32页 |
| 2.3.2 BMP2基因的设计及获得 | 第32-33页 |
| 2.3.3 质粒的提取 | 第33-34页 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| 2.3.5 双酶切和纯化 | 第34-35页 |
| 2.3.6 表达质粒的构建 | 第35-36页 |
| 2.3.7 DH5α感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.3.8 热转化 | 第36页 |
| 2.3.9 转化子的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.10 重组质粒线性化 | 第37页 |
| 2.3.11 线性化质粒的纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.12 GS115与X33感受态的制备 | 第38页 |
| 2.3.13 电穿孔转化 | 第38-39页 |
| 2.3.14 转化子筛选鉴定 | 第39-41页 |
| 2.3.15 高表达菌株的筛选 | 第41页 |
| 2.3.16 高表达菌株的鉴定 | 第41页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第41-48页 |
| 2.4.1 表达质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.4.2 DH5α阳性克隆筛选及验证 | 第42-43页 |
| 2.4.3 重组酵母菌株阳性克隆筛选 | 第43-46页 |
| 2.4.4 His+/Mut+表型筛选 | 第46页 |
| 2.4.5 高拷贝菌株的筛选 | 第46-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-51页 |
| 第三章 重组BMP2的表达鉴定及功能分析 | 第51-73页 |
| 3.1 前言 | 第51页 |
| 3.2 实验仪器和材料 | 第51-53页 |
| 3.2.1 主要仪器和设备 | 第51-52页 |
| 3.2.2 实验材料 | 第52-53页 |
| 3.3 重组酵母的小批诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.4 表达产物的鉴定 | 第54-55页 |
| 3.4.1 SDS-PAGE | 第54页 |
| 3.4.2 Western blot | 第54-55页 |
| 3.5 蛋白纯化 | 第55页 |
| 3.6 发酵条件的优化 | 第55-56页 |
| 3.6.1 毕赤酵母生长曲线 | 第55-56页 |
| 3.6.2 诱导时间 | 第56页 |
| 3.6.3 诱导甲醇浓度 | 第56页 |
| 3.6.4 诱导初始菌浓度 | 第56页 |
| 3.6.5 诱导培养基pH | 第56页 |
| 3.7 重组BMP2的定量分析 | 第56-57页 |
| 3.8 BMP2生物学活性测定 | 第57-59页 |
| 3.8.1 C2C12小鼠成肌细胞传代及培养 | 第57页 |
| 3.8.2 碱性磷酸酶活性测定 | 第57-58页 |
| 3.8.3 细胞增殖分化能力测定 | 第58页 |
| 3.8.4 茜素红法染色 | 第58页 |
| 3.8.5 细胞形态学鉴定 | 第58-59页 |
| 3.9 结果与讨论 | 第59-70页 |
| 3.9.1 SDS-PAGE分析 | 第59页 |
| 3.9.2 Western blot | 第59-60页 |
| 3.9.3 蛋白纯化分析 | 第60-61页 |
| 3.9.4 蛋白表达条件的优化 | 第61-66页 |
| 3.9.5 BMP2生物学活性测定结果 | 第66-70页 |
| 3.10 本章小结 | 第70-73页 |
| 第四章 全文总结 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 研究生期间发表文章及科研情况 | 第83-85页 |
| 附录 | 第85-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
