| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-25页 |
| 1 miRNA (micro RNA) | 第13-19页 |
| 1.1 miRNA的发现历程 | 第13-14页 |
| 1.2 miRNA的形成与作用机制 | 第14-16页 |
| 1.2.1 miRNA的形成 | 第14-15页 |
| 1.2.2 miRNA的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.3miRNA在毒理学中研究应用 | 第16-18页 |
| 1.3.1 miRNA在肿瘤中的作用 | 第16-17页 |
| 1.3.2 miRNA在病理中的作用 | 第17页 |
| 1.3.3 miRNA在调控网络中的作用 | 第17-18页 |
| 1.4 miR-203 和miR-217 的研究进展 | 第18-19页 |
| 2 miRNA的生物信息研究方法 | 第19-20页 |
| 3 miRNA分子生物研究方法 | 第20-23页 |
| 3.1 基因芯片方法检测miRNA表达 | 第20页 |
| 3.2 Northern Blot方法检测miRNA表达 | 第20-21页 |
| 3.3 荧光定量PCR检测miRNA的表达 | 第21页 |
| 3.4 生物信息学预测miRNA靶基因 | 第21-22页 |
| 3.5 生物学实验预测miRNA靶基因 | 第22页 |
| 3.6 生物学实验验证miRNA靶基因 | 第22-23页 |
| 4 核孔蛋白nup（nup43） | 第23页 |
| 5 斑马鱼与三唑磷 | 第23-25页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第25-29页 |
| 1 研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 2 研究主要内容 | 第26-28页 |
| 2.1 数据库芯片筛选lncRNA和miRNA | 第26页 |
| 2.2 生物信息软件预测miR-203 和miR-217 的靶基因 | 第26页 |
| 2.3 三唑磷处理斑马鱼miR-203 和miR-217 的表达变化 | 第26页 |
| 2.4 miR-203 和miR-217 与nup43基因 3’UTR间的相互作用 | 第26-27页 |
| 2.5 miR-203 和miR-217 分别对nup43 mRNA的调控作用 | 第27页 |
| 2.6 miR-203 和miR-217 对nup43蛋白表达的调控作用 | 第27页 |
| 2.7 miR-217 对斑马鱼细胞凋亡调控作用 | 第27-28页 |
| 3 实验流程图 | 第28-29页 |
| 第三章 材料与方法 | 第29-50页 |
| 1 材料与试剂 | 第29-36页 |
| 1.1 实验材料 | 第29页 |
| 1.2 主要仪器 | 第29-30页 |
| 1.3 主要试剂及来源 | 第30-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-50页 |
| 2.1 三唑磷处理斑马鱼 | 第36页 |
| 2.2 各组斑马鱼组织的总RNA提取 | 第36-37页 |
| 2.3 总RNA的定量与完整性检测 | 第37页 |
| 2.4 构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络 | 第37页 |
| 2.4.1 斑马鱼lncRNA芯片筛选 | 第37页 |
| 2.4.2 预测lncRNA-miRNA-mRNA基因 | 第37页 |
| 2.4.3 构建调控网络 | 第37页 |
| 2.5 斑马鱼nup43靶miRNA筛选 | 第37-38页 |
| 2.6 反转录与荧光定量PCR | 第38-40页 |
| 2.6.1 lncRNA-miRNA-mRNA引物设计 | 第38页 |
| 2.6.2 cDNA的合成（RT-PCR） | 第38-39页 |
| 2.6.3 qRT-PCR实验 | 第39-40页 |
| 2.7 nup433’UTR突变序列克隆和载体构建 | 第40-43页 |
| 2.7.1 斑马鱼的总RNA提取 | 第40页 |
| 2.7.2 引物设计 | 第40页 |
| 2.7.3 S-UTR、S-K.O-203 和S-K.O-217 的扩增 | 第40-42页 |
| 2.7.3.1 nup43的S-UTR扩增 | 第40-41页 |
| 2.7.3.2 S-K.O-203 的扩增 | 第41-42页 |
| 2.7.4 产物割胶回收 | 第42页 |
| 2.7.5 质粒提取 | 第42页 |
| 2.7.6 目的片段与载体双酶切 | 第42页 |
| 2.7.7 酶切产物纯化 | 第42-43页 |
| 2.7.8 重组质粒的构建与验证 | 第43页 |
| 2.7.8.1 重组质粒的构建 | 第43页 |
| 2.7.8.2 重组质粒的验证 | 第43页 |
| 2.8 验证miRNA与nup433’UTR作用关系 | 第43-45页 |
| 2.8.1 重组质粒的提取 | 第43页 |
| 2.8.2 细胞复苏与培养 | 第43-44页 |
| 2.8.3 转染效率测定 | 第44页 |
| 2.8.4 细胞共转染 | 第44-45页 |
| 2.8.5 荧光素酶表达检测 | 第45页 |
| 2.9 miRNA对nup43 mRNA与蛋白水平的调控 | 第45-46页 |
| 2.9.1 ZF4细胞转染mimic效率测定 | 第45-46页 |
| 2.9.2 2 种miRNA mimics转染ZF4细胞 | 第46页 |
| 2.9.3 ZF4细胞总RNA提取与荧光定量PCR | 第46页 |
| 2.10 总蛋白实验 | 第46-49页 |
| 2.10.1 特异性抗体制备 | 第47-48页 |
| 2.10.1.1 抗体多肽设计 | 第47页 |
| 2.10.1.2 多肽合成 | 第47页 |
| 2.10.1.3 ELISA实验检测抗血清效价 | 第47-48页 |
| 2.10.2 斑马鱼中总蛋白提取及Western Blot | 第48-49页 |
| 2.10.2.1 斑马鱼中总蛋白提取 | 第48页 |
| 2.10.2 2ZF4 细胞中总蛋白提取 | 第48-49页 |
| 2.10.2.3 总蛋白定量 | 第49页 |
| 2.10.2.4 蛋白Western Blot实验 | 第49页 |
| 2.11 ZF4细胞流式凋亡实验 | 第49-50页 |
| 第四章 结果与分析 | 第50-70页 |
| 1 斑马鱼的总RNA | 第50-51页 |
| 2 基因调控网络 | 第51-53页 |
| 2.1 lncRNA芯片筛选 | 第51页 |
| 2.2 分析lncRNA-miRNA-mRNA网络调控基因 | 第51-52页 |
| 2.3 GO功能分析与结合结构 | 第52-53页 |
| 3 nup43靶miRNA预测 | 第53-54页 |
| 4 三唑磷处理前后斑马鱼2种miRNA表达检测 | 第54-57页 |
| 5 重组质粒构建与验证 | 第57-65页 |
| 5.1 目的片段PCR扩增 | 第57-58页 |
| 5.2 重组质粒PCR验证与酶切验证 | 第58-59页 |
| 5.3 测序验证 | 第59-60页 |
| 5.4 质粒质量检测 | 第60页 |
| 5.5 293T细胞转染效率测定 | 第60-61页 |
| 5.6 荧光信号数据处理 | 第61-62页 |
| 5.7 ZF4细胞mimics转染效率 | 第62-63页 |
| 5.8 异位表达的miR-203 和miR-217 分别对nup43 mRNA的调控作用 | 第63-65页 |
| 6 免疫印迹相关实验 | 第65-69页 |
| 6.1 蛋白定量结果分析 | 第65-66页 |
| 6.2 血抗ELISA效价测定 | 第66-67页 |
| 6.3 血抗对nup43蛋白westering blotting | 第67页 |
| 6.4 三唑磷对斑马鱼中nup43蛋白水平的调控 | 第67-68页 |
| 6.5 ZF4细胞miRNA-203/217 异位表达调控nup43蛋白水平情况 | 第68-69页 |
| 7 miR-217 异位表达对细胞凋亡作用 | 第69-70页 |
| 第五章 讨论 | 第70-72页 |
| 第六章 总结与展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
