| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 综述 | 第12-22页 |
| 1 PEDV的研究进展 | 第12-17页 |
| 1.1 PEDV病毒的分类及基本特征 | 第12-13页 |
| 1.2 PEDV的理化特性和培养特性 | 第13-14页 |
| 1.3 PEDV的基因组结构以及编码主要蛋白的特性 | 第14-16页 |
| 1.3.1 PEDV的S蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3.2 PEDV的N蛋白 | 第15页 |
| 1.3.3 PEDV的E蛋白 | 第15-16页 |
| 1.3.4 PEDV的M蛋白 | 第16页 |
| 1.4 PEDV的流行病学及病理变化 | 第16-17页 |
| 2 PEDV的诊断方法研究进展 | 第17-19页 |
| 2.1 免疫电镜技术 | 第17页 |
| 2.2 免疫荧光技术 | 第17页 |
| 2.3 病毒的分离与鉴定法 | 第17-18页 |
| 2.4 RT-PCR法 | 第18页 |
| 2.5 血清中和试验 | 第18页 |
| 2.6 胶体金抗体检测技术 | 第18-19页 |
| 2.7 ELISA法 | 第19页 |
| 3 PEDV疫苗的种类 | 第19-20页 |
| 3.1 PEDV灭活疫苗 | 第19-20页 |
| 3.2 PEDV弱毒苗 | 第20页 |
| 3.3 PEDV基因工程疫苗 | 第20页 |
| 4 本研究的目的及意义 | 第20-22页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒S1-600基因的原核表达与鉴定 | 第22-37页 |
| 1 实验材料 | 第22-24页 |
| 1.1 载体和菌株 | 第22页 |
| 1.2 主要工具酶和试剂盒 | 第22页 |
| 1.3 主要实验仪器设备 | 第22-23页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第23-24页 |
| 2 试验方法 | 第24-30页 |
| 2.1 S1-600基因原核表达设计 | 第24页 |
| 2.2 重组表达载体的构建 | 第24-28页 |
| 2.2.1 引物的设计 | 第24-25页 |
| 2.2.2 S1-600基因片段的扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.3 目的基因的纯化 | 第26页 |
| 2.2.4 目的基因的连接 | 第26-27页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化 | 第27页 |
| 2.2.6 重组阳性质粒的提取 | 第27页 |
| 2.2.7 阳性重组质粒的酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.8 重组质粒序列测定及分析 | 第28页 |
| 2.3 阳性重组质粒pET28a-PEDV-S1-600的诱导表达与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3.1 重组质粒的诱导表达 | 第28-29页 |
| 2.3.2 重组蛋白的Western blot分析 | 第29页 |
| 2.4 重组蛋白诱导条件的优化 | 第29-30页 |
| 2.4.1 诱导温度条件的优化 | 第29页 |
| 2.4.2 IPTG诱导浓度的优化 | 第29-30页 |
| 2.4.3 诱导时间的优化 | 第30页 |
| 3 实验结果 | 第30-35页 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增结果 | 第30页 |
| 3.2 重组表达载体的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 3.3 重组质粒测序分析 | 第31页 |
| 3.4 重组质粒的诱导表达 | 第31-32页 |
| 3.5 重组蛋白Western blot鉴定 | 第32-33页 |
| 3.6 重组蛋白表达温度的优化 | 第33页 |
| 3.7 重组蛋白IPTG浓度的优化 | 第33-34页 |
| 3.8 重组蛋白诱导时间的优化 | 第34-35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| 4.1 PEDV抗原基因的选择 | 第35页 |
| 4.2 表达系统的选择 | 第35-37页 |
| 第三章 重组蛋白的纯化工艺 | 第37-42页 |
| 1 实验材料 | 第37-38页 |
| 1.1 试剂盒 | 第37页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第37-38页 |
| 2 试验方法 | 第38-40页 |
| 2.1 目的蛋白的诱导表达 | 第38页 |
| 2.2 镍柱的处理及蛋白纯化 | 第38-39页 |
| 2.3 蛋白的梯度复性 | 第39-40页 |
| 3 实验结果 | 第40页 |
| 3.1 重组Rosetta-pET28a-PEDV-S1-600蛋白的纯化结果 | 第40页 |
| 3.2 Bradford法测定蛋白浓度 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| 第四章 PEDV间接ELISA方法的建立 | 第42-56页 |
| 1 材料 | 第42-43页 |
| 1.1 实验材料 | 第42页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第42-43页 |
| 2 试验方法 | 第43-45页 |
| 2.1 ELISA抗体检测方法的操作步骤 | 第43页 |
| 2.2 抗原的最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定 | 第43-44页 |
| 2.3 抗原最佳包被条件的确定 | 第44页 |
| 2.4 最佳封闭液的确定 | 第44页 |
| 2.5 最佳封闭时间的确定 | 第44页 |
| 2.6 一抗最佳反应时间的确定 | 第44页 |
| 2.7 酶标二抗的最佳稀释倍数 | 第44页 |
| 2.8 酶标二抗(HRP-SPA)最佳反应时间的确定 | 第44-45页 |
| 2.9 底物最佳反应时间的确定 | 第45页 |
| 2.10 阴阳临界值的确定 | 第45页 |
| 2.11 特异性实验 | 第45页 |
| 2.12 敏感性实验 | 第45页 |
| 2.13 重复性试验 | 第45页 |
| 2.14 临床样品的检测 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-54页 |
| 3.1 S1-600蛋白的最佳包被浓度以及血清最佳稀释度的确定 | 第45-46页 |
| 3.2 抗原最适包被条件的确定 | 第46-47页 |
| 3.3 封闭液的确定 | 第47-48页 |
| 3.4 最佳封闭时间的确定 | 第48-49页 |
| 3.5 一抗最佳反应时间的确定 | 第49页 |
| 3.6 酶标二抗(HRP-SPA)的最佳稀释倍数 | 第49-50页 |
| 3.7 酶标二抗(HRP-SPA)的最佳反应时间确定 | 第50-51页 |
| 3.8 底物最佳反应时间的确定 | 第51页 |
| 3.9 阴阳临界值的确定 | 第51-52页 |
| 3.10 特异性实验 | 第52页 |
| 3.11 敏感性实验 | 第52-53页 |
| 3.12 重复性试验 | 第53页 |
| 3.13 临床检测 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 第五章 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 附录 | 第62-64页 |
| 附录A：质粒图谱 | 第62-63页 |
| 附录B：攻读学位期间获得研究成果 | 第63-64页 |
| 一、参与的科研项目 | 第63页 |
| 二、申请的专利 | 第63页 |
| 三、发表论文 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
