| 摘要 | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 文献综述 | 第11-20页 |
| 1 miRNA的生物合成及其功能 | 第11-14页 |
| 1.1 miRNA的细胞合成 | 第11-12页 |
| 1.2 miRNA与黑色素形成相关研究 | 第12-13页 |
| 1.3 miR-324-3p的研究进展 | 第13-14页 |
| 2 黑色素合成的相关基因 | 第14-17页 |
| 2.1 MC1R基因 | 第14-15页 |
| 2.2 Mitf基因 | 第15-16页 |
| 2.3 酪氨酸酶基因家族基因(Tyr、Tyrp1、Tyrp2) | 第16-17页 |
| 3 黑色素的细胞合成及检测 | 第17-19页 |
| 3.1 黑色素的细胞合成 | 第17-18页 |
| 3.2 体外黑色素含量的检测 | 第18-19页 |
| 4 本研究的研究目的意义 | 第19-20页 |
| 材料和方法 | 第20-34页 |
| 1 试验材料 | 第20-23页 |
| 1.1 试验样本 | 第20页 |
| 1.2 试验所用仪器设备 | 第20页 |
| 1.3 细胞培养所需主要试剂及耗材 | 第20-21页 |
| 1.4 载体构建所需主要试剂及耗材 | 第21页 |
| 1.5 双荧光素酶报告基因检测系统靶基因验证所需试剂 | 第21-22页 |
| 1.6 过表达载体转染细胞所需试剂耗材 | 第22页 |
| 1.7 总RNA提取、反转录PCR、qRT-PCR所需试剂及耗材 | 第22页 |
| 1.8 蛋白免疫印迹所需试剂及耗材 | 第22-23页 |
| 1.9 黑色素含量测定所需试剂及耗材 | 第23页 |
| 2 试验方法 | 第23-34页 |
| 2.1 羊驼皮肤黑色素细胞的培养 | 第23-24页 |
| 2.1.1 细胞复苏 | 第23-24页 |
| 2.1.2 细胞传代 | 第24页 |
| 2.1.3 细胞冻存 | 第24页 |
| 2.2 羊驼皮肤黑色素细胞总RNA的提取 | 第24页 |
| 2.3 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增及表达差异性验证 | 第24-26页 |
| 2.3.1 总RNA反转录PCR | 第24-25页 |
| 2.3.2 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.3.3 miR-324-3p在不同毛色羊驼皮肤中的表达差异性 | 第26页 |
| 2.4 miR-324-3p过表达载体转染羊驼皮肤黑色素细胞 | 第26-27页 |
| 2.5 双荧光素酶报告基因靶基因验证 | 第27-29页 |
| 2.5.1 pMD18T-MC1R-3'UTR Plasmid构建 | 第27-28页 |
| 2.5.2 pmirGLO-MC1R-3'UTR Plasmid构建 | 第28-29页 |
| 2.6 qRT-PCR检测不同试验组中MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2的表达差异性 | 第29-30页 |
| 2.7 Weatern Blotting | 第30-32页 |
| 2.7.1 黑色素细胞总蛋白提取 | 第30-31页 |
| 2.7.2 各目的蛋白及内参蛋白Western Blotting | 第31-32页 |
| 2.8 黑色素提取及含量测定 | 第32-34页 |
| 试验结果 | 第34-46页 |
| 3.1 羊驼miR-324-3p及其靶基因的预测 | 第34页 |
| 3.1.1 羊驼miR-324-3p成熟体 | 第34页 |
| 3.1.2 羊驼miR-324-3p靶基因的预测 | 第34页 |
| 3.2 羊驼皮肤黑色素细胞总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 3.3 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增及表达差异性检测 | 第35-37页 |
| 3.3.1 不同毛色羊驼黑色素细胞中miRNA-324-3p的扩增 | 第35-36页 |
| 3.3.2 miR-324-3p在不同毛色羊驼黑色素细胞中的表达差异性 | 第36页 |
| 3.3.3 转染过表达载体后羊驼黑色素细胞中miR-324-3p的表达差异性 | 第36-37页 |
| 3.4 构建的pmirGLO-MC1R-3'UTR载体图谱及其测序结果 | 第37-38页 |
| 3.4.1 pmirGLO-MC1R-3'UTR载体测序结果 | 第37页 |
| 3.4.2 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p测序结果及其载体图谱 | 第37-38页 |
| 3.5 双荧光素酶报告基因靶基因验证 | 第38-39页 |
| 3.6 qRT-PCR分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因的表达 | 第39-42页 |
| 3.6.1 表达载体转染羊驼皮肤黑色素细胞效率鉴定 | 第39-40页 |
| 3.6.2 MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因qRT-PCR扩增曲线 | 第40-41页 |
| 3.6.3 miR-324-3p对MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因表达的影响 | 第41-42页 |
| 3.7 蛋白免疫印迹分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2蛋白水平表达差异 | 第42-45页 |
| 3.7.1 羊驼皮肤黑色素细胞总蛋白条带 | 第42-43页 |
| 3.7.2 miR-324-3p对试验组中各目的基因在蛋白水平表达差异性的影响 | 第43-45页 |
| 3.8 miR-324-3p对黑色素产量的影响 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46-49页 |
| 4.1 miR-324-3p与黑色素合成 | 第46-47页 |
| 4.2 miR-324-3p对MC1R基因的影响 | 第47-49页 |
| 4.3 展望 | 第49页 |
| 结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-56页 |
| Abstract | 第56-57页 |
| 致谢 | 第58页 |
