| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 部分缩写及符号说明 | 第7-10页 |
| 一、引言 | 第10-15页 |
| 1 鸭疫里默氏菌的病原学特性 | 第10页 |
| 2 热休克蛋白家族 | 第10-14页 |
| 2.1 热休克蛋白70家族简介 | 第11-13页 |
| 2.2 热休克蛋白70家族的抗应激功能 | 第13-14页 |
| 3 选题的目的及意义 | 第14-15页 |
| 二、试验研究 | 第15-31页 |
| 1 材料 | 第15-17页 |
| 1.1 菌株、表达载体和试验动物 | 第15页 |
| 1.2 主要试剂 | 第15页 |
| 1.3 其它实验材料 | 第15页 |
| 1.4 常用试剂的配制 | 第15-17页 |
| 2 主要仪器设备 | 第17页 |
| 3 试验方法 | 第17-31页 |
| 3.1 RADNAK、DNAJ和GRPE基因的克隆、表达及纯化 | 第17-22页 |
| 3.1.1 引物设计 | 第17-18页 |
| 3.1.2 RA的DNA的提取 | 第18页 |
| 3.1.3 RA dnaK、dnaJ,grpE基因的PCR扩增 | 第18-19页 |
| 3.1.4 pET32a(+)dnaK、pBAD24dnaK、pET32a(+)dnaJ、pET32a(+)grpE表达载体的构建 | 第19-21页 |
| 3.1.5 重组蛋白的表达和纯化 | 第21-22页 |
| 3.2 DNAK的ATPASE活性检测(MALACHITE GREEN ASSAY) | 第22-24页 |
| 3.2.1 DnaK与DnaJ、GrpE相互作用的最佳比例 | 第22-23页 |
| 3.2.2 DnaK ATPase活性的最佳温度 | 第23-24页 |
| 3.3 RA DNAK的免疫性 | 第24-25页 |
| 3.3.1 鼠抗DnaK蛋白多克隆抗体的制备 | 第24页 |
| 3.3.2 RA DnaK的反应原性 | 第24-25页 |
| 3.4 不同应激条件对RA DNAK MRNA水平的影响 | 第25-28页 |
| 3.4.1 引物设计 | 第25页 |
| 3.4.2 菌体RNA的提取 | 第25-26页 |
| 3.4.3 标准品的制备 | 第26页 |
| 3.4.4 标准曲线的制备 | 第26页 |
| 3.4.5 不同环境胁迫鸭疫里默氏菌 | 第26-27页 |
| 3.4.6 cDNA的合成 | 第27页 |
| 3.4.7 Real-Time PCR | 第27-28页 |
| 3.5 RA DNAK在大肠杆菌中的作用 | 第28-31页 |
| 3.5.1 大肠杆菌dnaK缺失株的构建 | 第28-29页 |
| 3.5.2 热应激条件下RA DnaK在大肠杆菌中的作用 | 第29-31页 |
| 三、试验结果 | 第31-44页 |
| 1 RA的DNAK、DNAJ和GRPE基因克隆、表达及重组蛋白纯化 | 第31-32页 |
| 1.1 DNAK、DNAJ和GRPE基因的PCR扩增 | 第31页 |
| 1.2 DNAK、DNAJ和GRPE基因的亚克隆 | 第31-32页 |
| 2 重组蛋白的表达及纯化 | 第32-34页 |
| 2.1 重组蛋白表达的结果 | 第32-34页 |
| 2.2 重组蛋白的NI~(2+)-NTA亲和层析纯化 | 第34页 |
| 3 鼠抗DNAK血清的效价检测及WESTERN-BLOT分析 | 第34-35页 |
| 4 DNAK的ATPASE活性测定 | 第35-37页 |
| 4.1 不同浓度的DNAJ或GRPE作用时,DNAK的ATPASE活性 | 第35-36页 |
| 4.2 DNAK的ATPASE活性反应的最佳温度 | 第36-37页 |
| 5 RA在不同应激条件下DNAK的MRNA水平 | 第37-41页 |
| 5.1 标准品的制备 | 第37-38页 |
| 5.2 RA DNAK和16S RRNA标准曲线的制备 | 第38页 |
| 5.3 不同温度条件下RADNAK的MRNA水平 | 第38页 |
| 5.4 RA在酸碱胁迫下danK的mRNA水平 | 第38-39页 |
| 5.5 RA在氧化应激条件下DNAK的MRNA水平 | 第39-40页 |
| 5.6 RA在抗生素应激条件下DNAK的MRNA水平 | 第40页 |
| 5.7 RA在高渗透压下DNAK的MRNA水平 | 第40-41页 |
| 6 RA DNAK在大肠杆菌中的作用 | 第41-44页 |
| 6.1 DNAK LEFTARM、CMP、DNAK RIGHTARM的PCR扩增 | 第41-42页 |
| 6.2 重叠PCR扩增 | 第42页 |
| 6.3 XL1-BLUE DNAK缺失株构建的鉴定结果 | 第42-43页 |
| 6.4 在热应激条件下生长曲线的测定 | 第43-44页 |
| 四、讨论 | 第44-49页 |
| 1 RA DNAK、DNAJ、GRPE重组蛋白的表达和纯化 | 第44-45页 |
| 2 RA DNAK的ATPASE活性分析 | 第45-46页 |
| 3 RA DNAK的免疫性分析 | 第46页 |
| 4 不同应激条件对RA DNAK转录水平的影响 | 第46-47页 |
| 5 RA DNAK增强大肠杆菌对高温的耐受 | 第47-49页 |
| 五、结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-56页 |
| 致谢 | 第56页 |
