| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 常用英文缩写词汇 | 第11-24页 |
| 第一章 引言 | 第24-42页 |
| 1 鸭瘟病毒分子生物学研究概况 | 第24-28页 |
| ·鸭瘟病毒病原 | 第24页 |
| ·鸭瘟病毒粒子形态结构 | 第24-25页 |
| ·基因组结构 | 第25页 |
| ·鸭瘟病毒编码蛋白 | 第25-26页 |
| ·结构蛋白 | 第25-26页 |
| ·非结构蛋白 | 第26页 |
| ·鸭瘟病毒的复制周期 | 第26-28页 |
| 2 细菌人工染色体技术研究进展 | 第28-33页 |
| ·细菌人工染色体技术 | 第28页 |
| ·细菌人工染色体的修饰技术 | 第28-33页 |
| ·Red/ET介导的同源重组 | 第28-29页 |
| ·RecA蛋白介导的同源重组 | 第29-30页 |
| ·Cre/LoxP介导的同源重组 | 第30-32页 |
| ·Tn转座子介导的随机插入和突变技术 | 第32-33页 |
| ·细菌人工染色体在疱疹病毒研究研究中的应用 | 第33页 |
| 3 疱疹病毒UL55基因及编码蛋白功能研究进展 | 第33-41页 |
| ·疱疹病毒UL55基因及其编码蛋白的特点 | 第34-36页 |
| ·UL55基因序列的特点 | 第34页 |
| ·UL55基因的基因类型 | 第34-35页 |
| ·UL55基因编码蛋白的类型 | 第35页 |
| ·UL55编码蛋白的性质 | 第35-36页 |
| ·疱疹病毒UL55编码蛋白的定位 | 第36-37页 |
| ·UL55蛋白的亚细胞定位 | 第36页 |
| ·UL55蛋白在病毒自身内的定位 | 第36-37页 |
| ·疱疹病毒UL55蛋白的功能 | 第37-40页 |
| ·UL55蛋白与病毒复制 | 第37-38页 |
| ·UL55蛋白与转录调节 | 第38页 |
| ·UL55蛋白与免疫 | 第38页 |
| ·UL55同系物蛋白在DIPs感染中的作用 | 第38-39页 |
| ·UL55蛋白与核基质(细胞核骨架)的作用 | 第39页 |
| ·UL55蛋白与ICP35的关联 | 第39-40页 |
| ·UL55缺失的影响 | 第40页 |
| ·展望 | 第40-41页 |
| 4 本研究目的及意义 | 第41-42页 |
| 第二章 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 | 第42-68页 |
| 1 试验材料 | 第42页 |
| ·毒株 | 第42页 |
| 2 试验方法 | 第42-44页 |
| ·鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 | 第42页 |
| ·鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 | 第42-43页 |
| ·DPV CHv基因组基本特性分析 | 第42-43页 |
| ·DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 | 第43页 |
| ·DPV CHv基因组密码子使用模式分析 | 第43-44页 |
| ·DPV CHv密码子使用分析 | 第43页 |
| ·密码子参数之间的关联性分析 | 第43页 |
| ·DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类密码子对比分析 | 第43-44页 |
| 3 试验结果 | 第44-65页 |
| ·鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 | 第44-45页 |
| ·鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 | 第45-59页 |
| ·DPV CHv基因组基本特性分析 | 第45-48页 |
| ·DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 | 第48-59页 |
| ·DPV CHv基因组密码子使用模式分析 | 第59-65页 |
| ·DPV CHv密码子使用分析 | 第59-62页 |
| ·密码子参数之间的关联性分析 | 第62-63页 |
| ·DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类的密码子比较 | 第63-65页 |
| 4 讨论 | 第65-68页 |
| ·鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 | 第65-66页 |
| ·DPV CHv基因组密码子使用模式分析 | 第66-68页 |
| 第三章 鸭瘟病毒中国强毒株UL55基因生物信息学分析 | 第68-94页 |
| 1 试验材料 | 第68-71页 |
| ·毒株、鸭胚 | 第68页 |
| ·菌株/载体 | 第68-69页 |
| ·引物 | 第69页 |
| ·试剂、材料 | 第69-71页 |
| 2 试验方法 | 第71-76页 |
| ·DPV UL55基因T克隆 | 第71-75页 |
| ·鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备 | 第71-72页 |
| ·鸭瘟病毒的增殖 | 第72页 |
| ·DPV DNA提取 | 第72页 |
| ·UL55基因的PCR扩增 | 第72-73页 |
| ·DH5α化学感受态细胞的制备 | 第73页 |
| ·UL55基因的T克隆 | 第73-74页 |
| ·UL55基因T克隆质粒pMD18T/UL55的提取 | 第74页 |
| ·质粒PCR鉴定 | 第74页 |
| ·酶切鉴定 | 第74-75页 |
| ·DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 | 第75页 |
| ·开放性阅读框搜素及分子特性分析 | 第75页 |
| ·基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 | 第75页 |
| ·UL55基因密码子偏好性分析 | 第75页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 | 第75-76页 |
| 3 试验结果 | 第76-91页 |
| ·DPV UL55基因分子克隆 | 第76-77页 |
| ·DPV UL55基因的PCR | 第76页 |
| ·DPV UL55基因T克隆pMD18-T/UL55的鉴定 | 第76-77页 |
| ·DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 | 第77-86页 |
| ·开放性阅读框搜素及分子特性分析 | 第77页 |
| ·基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 | 第77-86页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 | 第86-91页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白基本特性分析 | 第86页 |
| ·DPV UL55基因及同系物氨基酸序列比对 | 第86-87页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白信号肽切割位点预测 | 第87页 |
| ·DPV UL55编码蛋白跨膜区预测 | 第87-88页 |
| ·DPV UL55编码蛋白亲疏水性分析 | 第88页 |
| ·DPV UL55编码蛋白磷酸化位点预测 | 第88-89页 |
| ·DPV UL55基因氨基酸序列N-糖基化位点预测 | 第89页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白功能位点预测 | 第89页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白抗原性分析 | 第89-90页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白质的细胞内定位 | 第90-91页 |
| ·DPV UL55基因氨基酸序列的二级结构预测 | 第91页 |
| 4 讨论 | 第91-94页 |
| ·DPV UL55基因及编码蛋白基本特性分析 | 第91-92页 |
| ·DPV UL55基因进化树分析 | 第92-93页 |
| ·DPV UL55基因密码子偏好性分析 | 第93-94页 |
| 第四章 鸭瘟病毒UL55基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第94-109页 |
| 1 试验材料 | 第94-96页 |
| ·毒株、鸭胚、试验动物 | 第94页 |
| ·菌株、载体 | 第94-95页 |
| ·试剂、材料 | 第95页 |
| ·主要试剂的配置 | 第95-96页 |
| ·IPTG溶液 | 第95页 |
| ·SDS-PAGE电泳相关溶液 | 第95-96页 |
| ·Western-Blot相关溶液 | 第96页 |
| ·蛋白纯化、复性试剂 | 第96页 |
| ·抗体制备、纯化试剂 | 第96页 |
| ·其他试剂 | 第96页 |
| ·仪器设备 | 第96页 |
| 2 试验方法 | 第96-103页 |
| ·原核表达质粒pET32a(+)/UL55的构建 | 第96-98页 |
| ·pMD18-T/UL55及pET32a(+)的质粒提取及酶切 | 第97页 |
| ·连接回收产物,构建pET-32a(+)/UL55重组表达质粒 | 第97页 |
| ·DH5α化学感受态细胞的制备 | 第97-98页 |
| ·重组表达质粒的转化 | 第98页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第98页 |
| ·重组表达质粒pET32a(+)/UL55的诱导表达 | 第98-99页 |
| ·重组表达质粒的提取 | 第98-99页 |
| ·重组表达质粒转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3) | 第99页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第99页 |
| ·重组质粒表达产物的可溶性分析 | 第99页 |
| ·重组表达质粒pET32a(+)/UL55表达诱导条件的优化 | 第99-100页 |
| ·诱导剂IPTG浓度优化 | 第99-100页 |
| ·诱导时间优化 | 第100页 |
| ·诱导温度优化 | 第100页 |
| ·重组UL55蛋白的大量制备、纯化与复性 | 第100-101页 |
| ·菌体的大量培养 | 第100页 |
| ·重组UL55蛋白的包涵体洗涤法大量纯化 | 第100-101页 |
| ·重组UL55蛋白的复性和检测 | 第101页 |
| ·重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的反应原性 | 第101-102页 |
| ·兔抗DPV CHv IgG的纯化 | 第101-102页 |
| ·重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的免疫印(western-blot) | 第102页 |
| ·兔抗UL55蛋白多克隆抗体的制备 | 第102-103页 |
| ·重组UL55蛋白抗原的制备 | 第102-103页 |
| ·免疫程序 | 第103页 |
| ·琼扩测定兔抗UL55蛋白抗体效价 | 第103页 |
| 3 试验结果 | 第103-107页 |
| ·原核表达质粒pET-32a(+)/UL55的构建与鉴定 | 第103-104页 |
| ·重组表达质粒pET3-2a(+)/UL55的诱导表达 | 第104页 |
| ·重组质粒pET-32a(+)/UL55诱导表达条件的优化 | 第104-105页 |
| ·重组UL55蛋白的纯化 | 第105-106页 |
| ·重组UL55蛋白与DPV抗血清的反应原性 | 第106-107页 |
| 4 讨论 | 第107-109页 |
| ·UL55重组蛋白表达系统的选择 | 第107-108页 |
| ·蛋白的表达和包涵体形成 | 第108页 |
| ·蛋白的纯化、复性 | 第108页 |
| ·兔抗多克隆抗体的制备和纯化 | 第108-109页 |
| 第五章 原核表达UL55蛋白作为抗原检测抗DPV血清的间接ELISA方法的建立及应用 | 第109-119页 |
| 1 试验材料 | 第109-110页 |
| ·蛋白 | 第109页 |
| ·血清 | 第109页 |
| ·试剂、材料 | 第109-110页 |
| ·仪器设备 | 第110页 |
| 2 试验方法 | 第110-112页 |
| ·重组UL55蛋白的原核表达蛋白、纯化及复性 | 第110页 |
| ·基于重组UL55蛋白的间接ELISA方法的建立 | 第110-112页 |
| ·基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法的基本程序 | 第110-111页 |
| ·抗原和血清最佳稀释度的选择 | 第111页 |
| ·酶标二抗最佳工作浓度优化 | 第111页 |
| ·UL55-ELISA阴阳性临界值的确定 | 第111页 |
| ·UL55-ELISA敏感性试验 | 第111-112页 |
| ·UL55-ELISA特异性试验 | 第112页 |
| ·阻断试验 | 第112页 |
| ·重复性试验 | 第112页 |
| ·UL55-ELISA的应用 | 第112页 |
| 3 试验结果 | 第112-116页 |
| ·重组UL55蛋白包被浓度和血清最佳稀释度的确定 | 第112-113页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第113页 |
| ·UL55-ELISA方法阴阳临界值的确定 | 第113-114页 |
| ·UL55-ELISA敏感性试验 | 第114页 |
| ·UL55-ELISA特异性试验 | 第114-115页 |
| ·UL55-ELISA阻断试验 | 第115页 |
| ·UL55-ELISA重复性试验 | 第115页 |
| ·UL55-ELISA与中和试验、DPV-ELISA对临床样本检测的比较分析 | 第115-116页 |
| 4 讨论 | 第116-119页 |
| ·包被抗原和血清对间接ELISA的影响 | 第116-117页 |
| ·酶标二抗对间接ELISA的影响 | 第117页 |
| ·pUL55-ELISA方法的条件优化 | 第117-118页 |
| ·基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法与诊断标准方法的比较 | 第118-119页 |
| 第六章 鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析 | 第119-133页 |
| 1 试验材料 | 第119-120页 |
| ·毒株/鸭胚 | 第119页 |
| ·菌株 | 第119页 |
| ·抗体 | 第119页 |
| ·引物 | 第119-120页 |
| ·试剂、材料 | 第120页 |
| ·仪器设备 | 第120页 |
| 2 试验方法 | 第120-124页 |
| ·DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 | 第120-123页 |
| ·质粒模板的制备 | 第120页 |
| ·引物特异性检测 | 第120-121页 |
| ·定量PCR标准曲线的建立 | 第121页 |
| ·RNA提取和cDNA合成 | 第121-123页 |
| ·样品的定量检测 | 第123页 |
| ·药物抑制试验 | 第123页 |
| ·DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相分析 | 第123-124页 |
| ·DEF制备与病毒增殖 | 第123页 |
| ·细胞蛋白的提取 | 第123-124页 |
| ·SDS-PAGE | 第124页 |
| ·Western-blot分析 | 第124页 |
| 3 试验结果 | 第124-130页 |
| ·DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 | 第124-129页 |
| ·引物特异性检测 | 第124-125页 |
| ·标准曲线的建立 | 第125-127页 |
| ·RNA纯度及完整性检测 | 第127页 |
| ·样品的定量检测 | 第127-128页 |
| ·药物抑制试验 | 第128-129页 |
| ·Western-blot分析DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相 | 第129-130页 |
| 4 讨论 | 第130-133页 |
| ·DPV UL55基因转录时相分析 | 第130-132页 |
| ·DPV UL55基因在感染宿主细胞中的表达时相分析 | 第132-133页 |
| 第七章 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建 | 第133-156页 |
| 1 试验材料 | 第133-135页 |
| ·毒株/鸭胚/试验动物/血清 | 第133页 |
| ·菌株/载体 | 第133-135页 |
| ·引物 | 第135页 |
| ·血清 | 第135页 |
| ·试剂、材料 | 第135页 |
| ·主要溶液的配制 | 第135页 |
| ·仪器设备 | 第135页 |
| 2 试验方法 | 第135-145页 |
| ·细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 | 第135-138页 |
| ·EGFP绿色荧光蛋白表达盒的克隆 | 第136-137页 |
| ·DPV CHv TK区域左右侧同源臂的克隆 | 第137-138页 |
| ·重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 | 第138页 |
| ·细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 | 第138-139页 |
| ·转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的提取 | 第138页 |
| ·转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11与DPV DNA共转染 | 第138-139页 |
| ·重组病毒DPV CHv-BAC-G的初步筛选、富集和纯化 | 第139页 |
| ·重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 | 第139页 |
| ·重组鸭瘟病毒电转化克隆的获取 | 第139-142页 |
| ·大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞的制备 | 第139-140页 |
| ·DPV CHv-BAC-G环化基因组DNA的提取 | 第140页 |
| ·电击转化筛选重组BAC克隆 | 第140-141页 |
| ·BAC转化子的鉴定 | 第141-142页 |
| ·菌落PCR | 第141-142页 |
| ·重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 | 第142-144页 |
| ·转染用pBAC-DPV的提取 | 第142页 |
| ·将pBAC-DPV转染进DEF | 第142页 |
| ·拯救DPV全基因组感染性克隆 | 第142-143页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 | 第143-144页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 | 第144-145页 |
| ·病毒定量(TCID50测定) | 第144页 |
| ·空斑试验 | 第144页 |
| ·一步生长曲线 | 第144-145页 |
| ·DPV CHv和DPV Chv-BAC-G对鸭的致病性比较 | 第145页 |
| 3 试验结果 | 第145-154页 |
| ·细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 | 第145-148页 |
| ·EGFP表达盒的扩增、克隆 | 第145-146页 |
| ·DPV左右同源臂的克隆 | 第146-148页 |
| ·重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 | 第148页 |
| ·细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 | 第148-150页 |
| ·重组病毒的初步筛选和纯化 | 第148-149页 |
| ·重组病毒的鉴定 | 第149-150页 |
| ·重组鸭瘟病毒电转化克隆子的获取 | 第150-151页 |
| ·重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 | 第151-153页 |
| ·拯救重组病毒的PCR鉴定 | 第151-152页 |
| ·拯救病毒的IFA鉴定 | 第152-153页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 | 第153-154页 |
| ·空斑试验 | 第153页 |
| ·一步生长曲线测定 | 第153-154页 |
| ·DPV CHv和DPV CHv-BAC-G对鸭的致病性比较 | 第154页 |
| 4 讨论 | 第154-156页 |
| 第八章 重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体内外生物学特性研究 | 第156-173页 |
| 1 试验材料 | 第156-158页 |
| ·毒株/鸭胚 | 第156页 |
| ·菌株/载体 | 第156-157页 |
| ·引物 | 第157-158页 |
| ·血清 | 第158页 |
| ·试剂、材料 | 第158页 |
| ·主要溶液的配制 | 第158页 |
| ·仪器设备 | 第158页 |
| 2 试验方法 | 第158-163页 |
| ·第一轮RED重组敲除UL55基因 | 第158-159页 |
| ·同源打靶片段的扩增、回收 | 第158页 |
| ·将pKD46转化至包含DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B中 | 第158-159页 |
| ·包含pKD46和DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B电转感受态细胞的制备 | 第159页 |
| ·电转化将线性打靶片段转入表达RED重组酶基因的菌株 | 第159页 |
| ·第二轮RED重组去除Kana抗性基因 | 第159-160页 |
| ·去除kana抗性基因 | 第159-160页 |
| ·第二轮RED重组鉴定 | 第160页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55 | 第160-161页 |
| ·中量提取DPV CHv-BAC-GAUL55质粒 | 第160页 |
| ·拯救DPV CHv-BAC-GAUL55病毒 | 第160页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55的鉴定 | 第160-161页 |
| ·DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 | 第161-163页 |
| ·UL55-Kana线性打靶片段的获取 | 第161-162页 |
| ·第一轮RED重组(将UL55-Kana重组到DPV CHv-BAC-G△UL55基因组) | 第162页 |
| ·第二轮RED重组(去除Kana) | 第162页 |
| ·RFLP分析 | 第162-163页 |
| ·DPV CHv-BAC-GAUL55/R的拯救及拯救病毒的鉴定 | 第163页 |
| ·拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 | 第163页 |
| 3 试验结果 | 第163-171页 |
| ·第一轮RED重组敲除UL55基因 | 第163-164页 |
| ·同源打靶片段的扩增 | 第163页 |
| ·转化pKD46的克隆子鉴定 | 第163-164页 |
| ·UL55基因缺失第一轮RED重组鉴定 | 第164页 |
| ·第二轮RED重组去除Kana抗性基因 | 第164-165页 |
| ·UL55基因缺失株DPV CHv-BAC-G△UL55的拯救 | 第165-166页 |
| ·DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 | 第166-170页 |
| ·UL55-Kana线性打靶片段的获取 | 第166-167页 |
| ·构建DPV CHv-BAC-G△UL55R回复株第一轮RED重组鉴定 | 第167页 |
| ·构建DPV CHv-BAC-GAUL55R回复株第二轮RED重组鉴定 | 第167-168页 |
| ·RFLP分析 | 第168-169页 |
| ·DPV CHv-BAC-G△UL55R的拯救及拯救病毒的鉴定 | 第169-170页 |
| ·DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 | 第170-171页 |
| ·空斑试验 | 第170-171页 |
| ·一步生长曲线测定 | 第171页 |
| 4 讨论 | 第171-173页 |
| 第九章 DPV UL55基因在感染宿主细胞内的定位分析 | 第173-186页 |
| 1 试验材料 | 第173-174页 |
| ·毒株/鸭胚 | 第173页 |
| ·血清 | 第173页 |
| ·试剂、材料 | 第173页 |
| ·主要溶液的配制 | 第173-174页 |
| ·仪器设备 | 第174页 |
| 2 试验方法 | 第174-176页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位 | 第174-175页 |
| ·间接免疫荧光检测DPV UL55蛋白的表达和亚细胞定位方法的建立 | 第174页 |
| ·间接免疫荧光检测条件优化 | 第174-175页 |
| ·间接免疫荧光检测UL55蛋白表达的结果判定 | 第175页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞中的动态定位监测 | 第175页 |
| ·与UL26.5的共定位情况分析 | 第175-176页 |
| ·鼠抗UL55多克隆抗体的制备 | 第175页 |
| ·鼠抗UL55多克隆抗体和兔抗UL26.5多克隆抗体的纯化 | 第175-176页 |
| ·UL55与UL26.5在DPV CHv感染宿主细胞内的共定位 | 第176页 |
| ·UL55蛋白对UL26.5蛋白在细胞内定位的作用分析 | 第176页 |
| 3 试验结果 | 第176-183页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 | 第176-180页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白与UL26.5的共定位分析 | 第180-183页 |
| 4 讨论 | 第183-186页 |
| ·DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 | 第183-184页 |
| ·UL55蛋白与UL26.5蛋白的共定位分析 | 第184-186页 |
| 全文总结 | 第186-188页 |
| 参考文献 | 第188-203页 |
