| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 符号及缩略说明表 | 第18-19页 |
| 上篇 文献综述 | 第19-81页 |
| 第一章 禾谷镰孢菌的经济重要性 | 第20-28页 |
| 1 禾谷镰孢菌的形态及生物学特性 | 第20-21页 |
| 2 引起的病害种类 | 第21-23页 |
| ·小麦赤霉病 | 第21-23页 |
| ·玉米茎基腐病及穗腐病 | 第23页 |
| ·水稻烂秧病 | 第23页 |
| 3 禾谷镰孢菌毒素 | 第23-24页 |
| 4 防治策略 | 第24-26页 |
| ·抗病品种的应用 | 第24页 |
| ·农业栽培措施 | 第24-25页 |
| ·化学防治 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-28页 |
| 第二章 微管、微管蛋白及抑制微管蛋白类药物和疫苗 | 第28-44页 |
| 1 微管 | 第28页 |
| 2 微管蛋白的结构 | 第28-29页 |
| 3 γ-微管蛋白与微管相关蛋白 | 第29页 |
| 4 微管的动力学特征 | 第29-30页 |
| 5 真菌微管蛋白的亚型及各自功能 | 第30-33页 |
| 6 抑制微管蛋白类药物 | 第33-37页 |
| ·抗肿瘤药物(长春花碱类、秋水仙碱类、紫杉醇类等) | 第33-35页 |
| ·杀菌剂(苯并咪唑类) | 第35页 |
| ·除草剂(二硝基苯胺类) | 第35-36页 |
| ·驱虫剂(苯并咪唑类) | 第36-37页 |
| 7 微管蛋白疫苗 | 第37-39页 |
| 参考文献 | 第39-44页 |
| 第三章 微管蛋白靶标类药物的抗性机制及抗药靶标的利用 | 第44-64页 |
| 1 肿瘤细胞对微管蛋白靶标类药物的抗药性机制 | 第44-45页 |
| 2 牛筋草对二硝基苯胺类除草剂的抗药性机制 | 第45-46页 |
| 3 寄生虫对苯并咪唑类驱虫药物的抗药性机制 | 第46页 |
| 4 植物病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性机制 | 第46-49页 |
| ·生化机制 | 第47页 |
| ·分子生物学机制 | 第47-48页 |
| ·其它机制 | 第48-49页 |
| 5 禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性研究进展 | 第49-52页 |
| ·抗药性测定方法及敏感性基线 | 第49-50页 |
| ·禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性现状 | 第50页 |
| ·抗药性菌株的性质 | 第50-51页 |
| ·抗药性遗传机制 | 第51页 |
| ·抗药性分子机制 | 第51-52页 |
| 6 苯并咪唑类杀菌剂的抗性治理 | 第52页 |
| 7 抗性靶标基因的利用 | 第52-56页 |
| ·在生防上的利用——提高生防菌对化学药剂的抵抗力 | 第52-54页 |
| ·分子生物学上的利用——筛选标记 | 第54页 |
| ·靶标蛋白的确定及药物管理策略的制定 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-64页 |
| 第四章 微管蛋白靶标类药物的离体筛选 | 第64-81页 |
| 1 微管蛋白的制备方法 | 第64-65页 |
| ·直接制备 | 第64页 |
| ·离子交换树脂纯化 | 第64-65页 |
| 2 微管蛋白的原核表达 | 第65-67页 |
| ·寄生虫微管蛋白的原核表达 | 第65-66页 |
| ·植物微管蛋白的原核表达 | 第66页 |
| ·丝状真菌微管蛋白的原核表达 | 第66页 |
| ·微管蛋白在其它系统里的表达 | 第66-67页 |
| 3 微管蛋白的同源模建及药剂结合位点 | 第67-69页 |
| ·真菌微管蛋白的同源模建 | 第67-68页 |
| ·二硝基苯胺类药剂在牛筋草α-微管蛋白上的结合位点 | 第68页 |
| ·苯并咪唑类及二硝基苯胺类药剂在寄生虫微管蛋白上的结合位点 | 第68-69页 |
| 4 α、β-微管蛋白的体外聚合 | 第69-71页 |
| 5 微管蛋白与药剂的体外结合 | 第71-74页 |
| ·同位素标记法 | 第71页 |
| ·荧光淬灭法 | 第71-73页 |
| ·半胱氨酸巯基化法 | 第73-74页 |
| 6 微管蛋白靶标类药物的离体筛选 | 第74-77页 |
| ·利用荧光淬灭进行药物离体筛选 | 第74页 |
| ·利用微管蛋白的体外聚合进行药物的离体筛选 | 第74-77页 |
| ·无荧光分子的加入 | 第75页 |
| ·荧光分子的加入 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 下篇 研究内容 | 第81-188页 |
| 第一章 禾谷镰孢菌α微管蛋白的原核表达及变性条件下的纯化 | 第82-100页 |
| 摘要 | 第82-83页 |
| 1 材料与方法 | 第83-88页 |
| ·材料 | 第83页 |
| ·供试菌株、质粒及宿主菌 | 第83页 |
| ·主要试剂 | 第83页 |
| ·方法 | 第83-88页 |
| ·寡核苷酸引物设计与合成 | 第83-84页 |
| ·表达前的分析方法 | 第84页 |
| ·RNA的提取、RT-PCR及α-微管蛋白基因扩增 | 第84-85页 |
| ·原核表达载体构建 | 第85-86页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及可溶性分析 | 第86-87页 |
| ·Western blot | 第87页 |
| ·包涵体透析复性 | 第87页 |
| ·复性蛋白的纯化 | 第87-88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-94页 |
| ·融合蛋白结构及表达特性预测 | 第88-90页 |
| ·阳性重组质粒的验证 | 第90页 |
| ·融合蛋白表达效率及存在形式 | 第90-92页 |
| ·融合蛋白验证 | 第92页 |
| ·包涵体的尿素洗涤 | 第92-93页 |
| ·融合蛋白的复性及纯化 | 第93-94页 |
| 3 结论与讨论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-98页 |
| ABSTRACT | 第98-100页 |
| 第二章 禾谷镰孢菌β_2-微管蛋白在大肠杆菌里的可溶性表达及纯化研究 | 第100-126页 |
| 摘要 | 第100-101页 |
| 1 材料与方法 | 第101-105页 |
| ·材料及主要试剂 | 第101-102页 |
| ·试验材料 | 第101页 |
| ·菌株、质粒 | 第101页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第101-102页 |
| ·方法 | 第102-105页 |
| ·引物设计与合成 | 第102页 |
| ·表达前的分析方法 | 第102页 |
| ·原核表达载体构建 | 第102-103页 |
| ·β_2-微管蛋白的诱导表达及可溶性分析 | 第103-104页 |
| ·β_2-微管蛋白表达条件优化 | 第104页 |
| ·β_2-微管蛋白的大量表达及可溶性蛋白的纯化 | 第104-105页 |
| ·β_2-微管蛋白的Western Blot验证 | 第105页 |
| 2 结果与分析 | 第105-118页 |
| ·融合蛋白的结构及表达特性预测 | 第105-107页 |
| ·阳性重组质粒的验证 | 第107页 |
| ·β_2-微管蛋白表达效率及存在形式分析 | 第107-108页 |
| ·β_2-微管蛋白可溶性表达条件 | 第108-113页 |
| ·温度对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第108-109页 |
| ·诱导物浓度对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第109页 |
| ·诱导时间对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第109-110页 |
| ·菌液浓度对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第110页 |
| ·培养液组分对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第110-111页 |
| ·诱导物对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第111-112页 |
| ·宿主菌对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第112页 |
| ·β_2-微管蛋白可溶性表达的条件 | 第112-113页 |
| ·可溶性微管蛋白的纯化 | 第113-117页 |
| ·微管蛋白的纯化设备 | 第113-114页 |
| ·结合缓冲液(Binding buffer)咪唑浓度优化 | 第114-115页 |
| ·洗涤缓冲液(Wash buffer)及洗脱缓冲液(Elution buffer)咪唑浓度优化 | 第115-116页 |
| ·可溶性β_2-微管蛋白的纯化 | 第116-117页 |
| ·β_2-微管蛋白的Western blot分析 | 第117-118页 |
| 3 结论与讨论 | 第118-122页 |
| 参考文献 | 第122-125页 |
| ABSTRACT | 第125-126页 |
| 第三章 禾谷镰孢菌α-微管蛋白在大肠杆菌里的可溶性表达及纯化 | 第126-140页 |
| 摘要 | 第126页 |
| 1 材料与方法 | 第126-128页 |
| ·材料 | 第126-127页 |
| ·供试载体 | 第126页 |
| ·主要试剂 | 第126-127页 |
| ·方法 | 第127-128页 |
| ·载体构建 | 第127页 |
| ·α-微管蛋白的可溶性表达 | 第127页 |
| ·α-微管蛋白的大量表达及可溶性蛋白的纯化 | 第127页 |
| ·α-微管蛋白的Western Blot验证 | 第127-128页 |
| 2 结果与分析 | 第128-132页 |
| ·α-微管蛋白可溶性表达的条件 | 第128-131页 |
| ·α_1-微管蛋白的可溶性表达 | 第128-129页 |
| ·α_2-微管蛋白的可溶性表达 | 第129页 |
| ·诱导条件优化对α-微管蛋白表达的影响 | 第129-131页 |
| ·自然条件下α-微管蛋白的纯化 | 第131页 |
| ·α-微管蛋白的Western blot分析 | 第131-132页 |
| 3 结论与讨论 | 第132-136页 |
| 参考文献 | 第136-138页 |
| ABSTRACT | 第138-140页 |
| 第四章 禾谷镰孢菌α、β_2-微管蛋白的体外聚合研究 | 第140-156页 |
| 摘要 | 第140页 |
| 1 材料与方法 | 第140-143页 |
| ·材料 | 第140-141页 |
| ·所用试剂 | 第140-141页 |
| ·方法 | 第141-143页 |
| ·微管蛋白的大量表达及制备 | 第141页 |
| ·微管蛋白的透析、浓缩、保存 | 第141页 |
| ·微管蛋白的体外聚合方法 | 第141-142页 |
| ·多菌灵对禾谷镰孢菌α、β_2-微管蛋白体外聚合的影响 | 第142-143页 |
| ·微管蛋白聚合反应作为药剂筛选靶标的研究 | 第143页 |
| 2 结果与分析 | 第143-148页 |
| ·α、β_2-微管蛋白的体外聚合 | 第143-144页 |
| ·多菌灵对α、β_2-微管蛋白体外聚合的影响 | 第144-146页 |
| ·药物对α、β_2-微管蛋白体外聚合的影响 | 第146-148页 |
| 3 结论与讨论 | 第148-152页 |
| 参考文献 | 第152-155页 |
| ABSTRACT | 第155-156页 |
| 第五章 禾谷镰孢菌不同抗性菌株β_2-微管蛋白的可溶性表达及同α_1-微管蛋白的体外聚合研究 | 第156-174页 |
| 摘要 | 第156-157页 |
| 1 材料与方法 | 第157-160页 |
| ·材料 | 第157-158页 |
| ·菌株及载体 | 第157-158页 |
| ·主要试剂 | 第158页 |
| ·方法 | 第158-160页 |
| ·寡核苷酸引物设计与合成 | 第158-159页 |
| ·RNA的提取、RT-PCR及β_2-微管蛋白基因扩增 | 第159页 |
| ·原核表达载体构建 | 第159页 |
| ·β_2-微管蛋白可溶性表达及纯化 | 第159页 |
| ·融合蛋白的Western blot鉴定 | 第159页 |
| ·α_1、β_2-微管蛋白的体外聚合 | 第159-160页 |
| 2 结果与分析 | 第160-168页 |
| ·阳性重组质粒验证 | 第160-161页 |
| ·β2-微管蛋白的诱导表达 | 第161-164页 |
| ·常规诱导条件下β_2-微管蛋白的表达 | 第161-162页 |
| ·不同位点氨基酸突变对β_2-微管蛋白总蛋白产量的影响 | 第162页 |
| ·β_2-微管蛋白在常规诱导及可溶性诱导下上清中蛋白量的对比 | 第162-163页 |
| ·不同位点氨基酸突变对β_2-微管蛋白可溶性表达的影响 | 第163-164页 |
| ·可溶性β_2-微管蛋白的纯化及Western blot分析 | 第164-166页 |
| ·不同抗性菌株β_2-微管蛋白与α_1-微管蛋白的体外聚合 | 第166-168页 |
| ·标签蛋白对微管蛋白体外聚合的影响 | 第166页 |
| ·β_2-微管蛋白不同位点氨基酸突变对聚合的影响 | 第166页 |
| ·多菌灵对α_1、β_2-微管蛋白体外聚合的影响 | 第166-168页 |
| 3 结论与讨论 | 第168-170页 |
| 参考文献 | 第170-172页 |
| ABSTRACT | 第172-174页 |
| 第六章 禾谷镰孢菌β-微管蛋白与多菌灵的体外结合研究 | 第174-188页 |
| 摘要 | 第174-175页 |
| 1 材料与方法 | 第175-178页 |
| ·材料 | 第175页 |
| ·所用试剂 | 第175页 |
| ·多菌灵母液的配置 | 第175页 |
| ·方法 | 第175-178页 |
| ·β-微管蛋白的制备 | 第175页 |
| ·微管蛋白的透析、浓缩、保存 | 第175-176页 |
| ·荧光淬灭的测定方法 | 第176页 |
| ·多菌灵对β-微管蛋白的荧光淬灭分析 | 第176页 |
| ·多菌灵与β-微管蛋白的结合平衡分析 | 第176-177页 |
| ·多菌灵与β-微管蛋白结合的动力学研究 | 第177-178页 |
| 2 结果与分析 | 第178-181页 |
| ·融合蛋白上色氨酸数目及位点 | 第178页 |
| ·多菌灵对β-微管蛋白的荧光淬灭 | 第178-179页 |
| ·多菌灵同β-微管蛋白的结合平衡 | 第179-180页 |
| ·多菌灵和β-微管蛋白体外结合的动力学特性 | 第180-181页 |
| 3 结论与讨论 | 第181-184页 |
| 参考文献 | 第184-187页 |
| ABSTRACT | 第187-188页 |
| 全文小结 | 第188-190页 |
| 一、本研究获得的主要结果 | 第188页 |
| 二、本文创新点 | 第188页 |
| 三、本文尚待解决的问题 | 第188-190页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第190-192页 |
| 致谢 | 第192-193页 |
