| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACTS | 第7-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一章 RNA 干扰研究进展 | 第14-33页 |
| ·RNA 干扰研究的历史背景 | 第14-15页 |
| ·RNAi 的作用机制 | 第15-18页 |
| ·siRNA | 第16页 |
| ·Dicer 酶 | 第16-17页 |
| ·RISC | 第17页 |
| ·RdRp | 第17-18页 |
| ·RNAi 的作用特点 | 第18-19页 |
| ·特异性 | 第18页 |
| ·高效性 | 第18页 |
| ·转移性 | 第18页 |
| ·稳定性好 | 第18页 |
| ·设计、操作简便 | 第18-19页 |
| ·siRNA 的设计及修饰 | 第19-21页 |
| ·siRNA 分子的制备 | 第21-22页 |
| ·化学合成法 | 第21页 |
| ·体外转录法 | 第21页 |
| ·长dsRNA 酶切法 | 第21页 |
| ·载体介导的表达siRNA 法 | 第21-22页 |
| ·基于 PCR 的siRNA 表达框架法 | 第22页 |
| ·siRNA 的转染方法 | 第22-24页 |
| ·磷酸钙法 | 第22页 |
| ·电穿孔法 | 第22-23页 |
| ·DEAE-葡聚糖法 | 第23页 |
| ·阳离子脂质体法 | 第23页 |
| ·显微注射法 | 第23页 |
| ·阳离子聚合物法 | 第23页 |
| ·病毒载体导入法 | 第23-24页 |
| ·RNAi 的应用 | 第24-33页 |
| ·基因功能的研究 | 第24-25页 |
| ·抗病毒感染 | 第25-29页 |
| ·基因治疗 | 第29-30页 |
| ·信号传导研究的应用 | 第30-31页 |
| ·干细胞中的应用 | 第31-33页 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 | 第33-40页 |
| ·CSFV 病毒粒子的形态学、理化以及细胞培养特性研究 | 第33-34页 |
| ·CSFV 基因组研究 | 第34-35页 |
| ·CSFV 功能基因研究 | 第35-37页 |
| ·CSFV 与宿主细胞的相互作用及其致病机制 | 第37-40页 |
| 第三章 猪瘟病毒差异基因的筛选与鉴定 | 第40-60页 |
| ·材料 | 第40-44页 |
| ·猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养所需材料及相关试剂 | 第40-42页 |
| ·菌株及毒株 | 第42页 |
| ·siRNA 重组干扰表达载体构建与鉴定所需相关材料及试剂 | 第42-43页 |
| ·仪器设备 | 第43-44页 |
| ·方法 | 第44-53页 |
| ·猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养 | 第44-45页 |
| ·靶向猪瘟病毒差异基因shRNA 干扰载体的构建与鉴定 | 第45-52页 |
| ·重组干扰表达载体转染猪脐静脉内皮细胞 | 第52页 |
| ·shRNA 沉默CSFV 差异基因后猪瘟病毒致SVEC 病变效应 | 第52-53页 |
| ·结果 | 第53-57页 |
| ·分离培养的猪脐静脉血管内皮细胞 | 第53页 |
| ·重组干扰质粒的鉴定结果 | 第53-54页 |
| ·重组干扰载体转录的shRNA 对内皮细胞的影响 | 第54页 |
| ·shRNA 沉默CSFV 差异基因后猪瘟病毒致SVEC 病变效应 | 第54-57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| ·小结 | 第59-60页 |
| 第四章 猪瘟病毒差异基因cDNA 序列的延伸 | 第60-80页 |
| ·材料 | 第60-62页 |
| ·毒株、菌株、细胞 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60-61页 |
| ·细胞培养所需溶液 | 第61页 |
| ·ATV 消化液 | 第61页 |
| ·引物设计 | 第61-62页 |
| ·主要仪器 | 第62页 |
| ·方法 | 第62-70页 |
| ·猪瘟病毒接种猪血管内皮细胞 | 第62页 |
| ·细胞总 RNA 的提取 | 第62-63页 |
| ·RNA 的纯化 | 第63页 |
| ·猪瘟病毒差异基因5’末端未知序列的延伸 | 第63-67页 |
| ·猪瘟病毒差异基因3’末端未知序列的延伸 | 第67-70页 |
| ·结果 | 第70-77页 |
| ·5’RACE PCR 扩增结果 | 第70页 |
| ·5’RACE 酶切鉴定结果 | 第70-71页 |
| ·5’RACE 获得的序列 | 第71页 |
| ·3’RACE PCR 扩增结果 | 第71页 |
| ·3’RACE 酶切鉴定结果 | 第71页 |
| ·3’RACE 获得的序列 | 第71-72页 |
| ·序列拼接及同源性分析 | 第72-77页 |
| ·讨论 | 第77-78页 |
| ·小结 | 第78-80页 |
| 第五章 载体介导的shRNA 抑制猪瘟病毒在 PK15 细胞中增殖 | 第80-96页 |
| ·材料 | 第80-82页 |
| ·毒株，菌株、细胞与载体 | 第80页 |
| ·工具酶及相关试剂 | 第80-81页 |
| ·细胞培养所需溶液 | 第81页 |
| ·D-Hank’s 缓冲液 | 第81页 |
| ·ATV 消化液 | 第81页 |
| ·主要仪器 | 第81-82页 |
| ·方法 | 第82-90页 |
| ·特异性干扰序列的设计 | 第82-83页 |
| ·pGene-NS3-1 干扰片断的退火 | 第83页 |
| ·pGenesil-1 表达载体的酶切 | 第83页 |
| ·重组表达载体酶切产物的纯化回收 | 第83-84页 |
| ·退火后的pGene-NS3-1 干扰片断与表达载体酶切产物的连接 | 第84页 |
| ·连接产物的转化 | 第84-85页 |
| ·pGene-NS3-1 重组质粒的提取与鉴定 | 第85-86页 |
| ·pGene-NS3-1 重组干扰载体的序列测定 | 第86页 |
| ·重组干扰载体转染级别的纯化 | 第86页 |
| ·PK-15 细胞的复苏与培养 | 第86页 |
| ·G418 真核细胞最佳筛选浓度的测定 | 第86页 |
| ·重组干扰载体转染 PK-15 细胞 | 第86-87页 |
| ·阳性克隆细胞的筛选与扩大培养 | 第87页 |
| ·猪瘟病毒接种阳性细胞 | 第87页 |
| ·猪瘟病毒基因的 Real-Time PCR 检测 | 第87-89页 |
| ·猪瘟病毒粒子的 ELISA 分析 | 第89-90页 |
| ·结果 | 第90-93页 |
| ·重组干扰载体的酶切鉴定 | 第90页 |
| ·G418 最佳筛选浓度结果 | 第90页 |
| ·阳性克隆细胞的筛选结果 | 第90-91页 |
| ·扩大培养的阳性克隆细胞 | 第91-92页 |
| ·猪瘟病毒基因的实时定量 PCR 分析结果 | 第92-93页 |
| ·猪瘟病毒粒子的 ELISA 检测分析结果 | 第93页 |
| ·讨论 | 第93-95页 |
| ·小结 | 第95-96页 |
| 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 作者简介 | 第110-111页 |
| 附录 | 第111-113页 |
