| 独创性声明 | 第1页 |
| 关于论文使用授权的说明 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 1 引言 | 第10-16页 |
| ·背景 | 第10-12页 |
| ·炭疽及其致病菌 | 第10页 |
| ·炭疽毒素及其致病机制 | 第10-12页 |
| ·炭疽的治疗性抗体的研发进展 | 第12-14页 |
| ·前景展望 | 第14页 |
| ·本研究的目的与意义 | 第14页 |
| ·本研究的思路及论文组成 | 第14-15页 |
| ·研究结果 | 第15-16页 |
| 2 炭疽杆菌保护性抗原第四结构域基因的克隆、表达与纯化 | 第16-30页 |
| ·材料 | 第16-19页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·质粒 | 第16页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第16-17页 |
| ·主要生化试剂 | 第17页 |
| ·主要工具酶、单抗及试剂盒 | 第17页 |
| ·主要试剂的配制 | 第17-18页 |
| ·主要仪器设备 | 第18-19页 |
| ·计算机软件包 | 第19页 |
| ·方法 | 第19-23页 |
| ·PCR 合成目的DNA 片段 | 第19页 |
| ·分离、鉴定和纯化DNA 片段 | 第19-20页 |
| ·DNA 片段的回收 | 第20页 |
| ·DNA 的定量 | 第20页 |
| ·与载体pGEM-T 连接 | 第20页 |
| ·转化大肠杆菌DH5ａ感受态菌 | 第20页 |
| ·质粒提取 | 第20-21页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第21页 |
| ·表达载体构建 | 第21页 |
| ·PCR 鉴定 | 第21页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第21页 |
| ·SDS—PAGE 电泳 | 第21-22页 |
| ·纯化 | 第22页 |
| ·透析 | 第22页 |
| ·Western Blot 检测 | 第22页 |
| ·目的蛋白的浓度测定 | 第22-23页 |
| ·结果 | 第23-25页 |
| ·重叠延伸PCR 法合成PA 第四结构域基因 | 第23页 |
| ·重组质粒pGEMT-PAD4 的构建 | 第23-24页 |
| ·重组表达载体 PET-22b(+)-GⅢ-PAD4 的构建 | 第24页 |
| ·重组融合蛋白的表达和纯化 | 第24-25页 |
| ·BCA 法测PAD4 的浓度 | 第25页 |
| ·Western-blot 分析 | 第25页 |
| ·讨论 | 第25-29页 |
| ·小结 | 第29-30页 |
| 3 抗炭疽杆菌保护性抗原第四结构域的噬菌体抗体的筛选及鉴定 | 第30-41页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·菌种与质粒 | 第30页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第30页 |
| ·抗体库 | 第30页 |
| ·主要试剂 | 第30页 |
| ·ELISA 所用溶液 | 第30页 |
| ·主要设备及耗材 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-33页 |
| ·全合成人噬菌体抗体库的呈现 | 第31页 |
| ·固相亲和筛选 | 第31页 |
| ·噬菌体人ScFv 抗体库的扩增 | 第31-32页 |
| ·辅助噬菌体的制备 | 第32页 |
| ·噬菌体抗体库和辅助噬菌体滴度的测定 | 第32页 |
| ·阳性克隆的ELISA 鉴定 | 第32-33页 |
| ·阳性克隆的酶切及PCR 鉴定 | 第33页 |
| ·阳性噬菌体抗体的序列测定 | 第33页 |
| ·重组抗体可变区序列分析 | 第33页 |
| ·结果 | 第33-39页 |
| ·抗炭疽毒素保护性抗原第四结构域ScFv 的筛选 | 第33-34页 |
| ·对抗炭疽毒素保护性抗原第四结构域ScFv 的单克隆鉴定 | 第34-39页 |
| ·讨论 | 第39-40页 |
| ·小结 | 第40-41页 |
| 4 单链抗体在大肠杆菌中的克隆表达及初步鉴定 | 第41-51页 |
| ·材料 | 第41页 |
| ·菌株和载体 | 第41页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第41页 |
| ·所需引物 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-44页 |
| ·噬菌体抗体AP、APD17、APD22 基因克隆入表达载体 | 第41-42页 |
| ·噬菌体抗体APDC 基因突变并克隆入表达载体 | 第42-43页 |
| ·诱导表达 | 第43页 |
| ·ELISA 检测 | 第43页 |
| ·竞争ELISA 检测 | 第43页 |
| ·Western-Blot 检测 | 第43-44页 |
| ·结果 | 第44-48页 |
| ·酶切鉴定 | 第44页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白的表达 | 第44-45页 |
| ·单链抗体AP、APDC、APD17、APD22 可溶性表达产物特异性鉴定 | 第45-48页 |
| ·Western-Blot 检测 | 第48页 |
| ·讨论 | 第48-50页 |
| ·进行大肠杆菌可溶性表达的必要性 | 第48页 |
| ·抗体APDC 基因突变的必要性 | 第48-49页 |
| ·抗体的原核可溶性表达 | 第49-50页 |
| ·小结 | 第50-51页 |
| 5 研究结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-55页 |
| 作者简介 | 第55-56页 |
| 导师简介 | 第56-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 博硕士学位论文同意发表声明 | 第58页 |
