| 第一章 前言 | 第1-30页 |
| 1 新型抗病毒抗肿瘤苦瓜蛋白MAP30的研究进展 | 第10-17页 |
| ·MAP30的结构 | 第10-11页 |
| ·MAP30的药理作用 | 第11-14页 |
| ·抗病毒 | 第11-12页 |
| ·抗肿瘤 | 第12-13页 |
| ·抗菌 | 第13页 |
| ·细胞毒性 | 第13-14页 |
| ·MAP30的作用机理 | 第14-16页 |
| ·RNA N-糖苷酶活性 | 第14页 |
| ·DNA拓扑失活活性 | 第14-15页 |
| ·抑制HIV-1整合酶活性 | 第15-16页 |
| ·抑制HIV-1整合酶的3’末端加工活性 | 第15页 |
| ·抑制HIV-1整合酶的链转移活性 | 第15页 |
| ·抑制HIV-1整合酶的去整合活性 | 第15-16页 |
| ·MAP30的重组生产 | 第16页 |
| ·展望 | 第16-17页 |
| 2 大肠杆菌表达系统的研究进展 | 第17-27页 |
| ·表达载体 | 第17-20页 |
| ·复制子 | 第18页 |
| ·抗性标记 | 第18页 |
| ·启动子 | 第18-19页 |
| ·转录终止子 | 第19-20页 |
| ·表达宿主菌 | 第20-22页 |
| ·蛋白酶缺陷型菌株 | 第20页 |
| ·还原酶突变型菌株 | 第20-21页 |
| ·氨基酸营养缺陷型菌株 | 第21页 |
| ·补充稀有密码子型菌株 | 第21页 |
| ·其他类型菌株 | 第21-22页 |
| ·重组蛋白的定位表达 | 第22-26页 |
| ·细胞质表达 | 第23-24页 |
| ·以可溶形式表达 | 第23页 |
| ·以包涵体形式表达 | 第23-24页 |
| ·分泌表达 | 第24-26页 |
| ·分泌到细胞周质空间 | 第24页 |
| ·分泌到培养基 | 第24-25页 |
| ·细胞表面展示 | 第25-26页 |
| ·pET表达系统简介 | 第26-27页 |
| 3 本研究的意义、目的 | 第27-28页 |
| 4 实验技术路线 | 第28-29页 |
| 5 大肠杆菌表达载体构建示意图 | 第29-30页 |
| 第二章 MAP30基因克隆及其原核表达 | 第30-44页 |
| 1 材料与方法 | 第30-39页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·主要生化试剂 | 第30页 |
| ·主要实验仪器 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-39页 |
| ·引物设计与合成 | 第31页 |
| ·苦瓜总DNA的提取 | 第31页 |
| ·MAP30基因的克隆 | 第31-32页 |
| ·PCR扩增MAP30基因 | 第31-32页 |
| ·PCR扩增产物回收 | 第32页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定 | 第32-34页 |
| ·PCR回收产物与克隆载体T-easy Vector的连接 | 第32-33页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第33页 |
| ·重组质粒的提取 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒的序列分析 | 第34页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| ·MAP30基因的制备 | 第34-35页 |
| ·表达载体pET30a的制备 | 第35页 |
| ·MAP30基因与表达载体的连接 | 第35页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第35页 |
| ·工程菌BL21(DE3)／pET-30a-MAP30的构建与筛选 | 第35-37页 |
| ·pET-30a-MAP30质粒的制备 | 第35-36页 |
| ·E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第36页 |
| ·菌落PCR筛选阳性克隆 | 第36-37页 |
| ·MAP30基因的诱导表达 | 第37页 |
| ·重组蛋白SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| ·重组蛋白可溶性分析 | 第38页 |
| ·最佳诱导温度分析 | 第38-39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-43页 |
| ·苦瓜总DNA的提取 | 第39页 |
| ·MAP30基因的扩增 | 第39-40页 |
| ·克隆载体pGEM-MAP30的构建 | 第40页 |
| ·表达载体pET-30a-MAP30的构建 | 第40-41页 |
| ·工程菌株BL21(DE3)／pET-30a-MAP30的构建 | 第41页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·最佳诱导温度分析 | 第42页 |
| ·重组MAP30可溶性分析 | 第42-43页 |
| 3 讨论 | 第43-44页 |
| 第三章 重组MAP30蛋白的分离纯化 | 第44-49页 |
| 1 材料与方法 | 第44-46页 |
| ·材料 | 第44-45页 |
| ·菌株 | 第44页 |
| ·主要化学试剂 | 第44页 |
| ·缓冲液 | 第44页 |
| ·主要实验仪器 | 第44-45页 |
| ·方法 | 第45-46页 |
| ·工程菌的摇瓶发酵 | 第45页 |
| ·发酵液的处理 | 第45页 |
| ·亲和层析分离重组MAP30蛋白 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE分析纯化组分 | 第45页 |
| ·Western blot分析重组蛋白 | 第45-46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-48页 |
| ·分离纯化 | 第46-47页 |
| ·Western blot检测 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 第四章 重组MAP30蛋白抗肿瘤活性分析 | 第49-56页 |
| 1 材料与方法 | 第49-51页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·细胞株 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·细胞培养用液 | 第49-50页 |
| ·灭活小牛血清 | 第49页 |
| ·青霉素、链霉素(双抗液) | 第49页 |
| ·RPMI-1640基础培养基 | 第49页 |
| ·RPMI-1640血清细胞培养基 | 第49页 |
| ·Hanks液 | 第49-50页 |
| ·0.25％胰蛋白酶 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| ·方法 | 第50-51页 |
| ·细胞培养 | 第50-51页 |
| ·细胞复苏 | 第50-51页 |
| ·细胞传代 | 第51页 |
| ·生物活性测定 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-54页 |
| ·细胞形态观察 | 第51-53页 |
| ·MTT活性分析 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 第五章 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-69页 |
| 附录 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
