| 中文摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-34页 |
| 1． N，O-二乙酰胞壁质酶的研究进展 | 第12-17页 |
| 1．1 N，O-二乙酰胞壁质酶的生化性质 | 第12-14页 |
| 1．2 N，O-二乙酰胞壁质酶的分子生物学研究 | 第14页 |
| 1．3 N，O-二乙酰胞壁质酶的应用 | 第14-16页 |
| 1．3．1 食品工业上的应用 | 第14-15页 |
| 1．3．2 酶工程上的应用 | 第15页 |
| 1．3．3 在医学上的应用 | 第15-16页 |
| 1．4 溶菌酶基因 工程菌株研究现状 | 第16-17页 |
| 2． 枯草芽孢杆菌表达系统研究进展 | 第17-22页 |
| 2．1 芽孢杆菌的特点 | 第17页 |
| 2．2 芽孢杆菌表达系统的早期研究工作 | 第17-18页 |
| 2．2．1 枯草杆菌作为可转化菌株的发现 | 第17-18页 |
| 2．2．2 枯草杆菌的载体发现 | 第18页 |
| 2．3 枯草杆菌宿主菌株 | 第18页 |
| 2．4 枯草杆菌表达系统中的载体 | 第18-20页 |
| 2．4．1 自主复制质粒 | 第18-19页 |
| 2．4．2 噬菌体 | 第19页 |
| 2．4．3 染色体整合质粒 | 第19-20页 |
| 2．5 芽孢杆菌的基因表达特点 | 第20页 |
| 2．6 芽孢杆菌以表达的基因 | 第20-21页 |
| 2．7 芽孢杆菌表达系统存在的问题及今后发展方向 | 第21-22页 |
| 2．8 展望 | 第22页 |
| 3． 毕赤酵母表达系统研究进展 | 第22-31页 |
| 3．1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 | 第23页 |
| 3．2 毕赤酵母的生物学特性 | 第23-24页 |
| 3．3 毕赤酵母的遗传学特征 | 第24页 |
| 3．4 毕赤酵母表达外源蛋白 | 第24-27页 |
| 3．4．1 表达载体 | 第24-25页 |
| 3．4．2 载体的转化与整合 | 第25页 |
| 3．4．3 宿主菌 | 第25-26页 |
| 3．4．4 胞内表达和分泌表达 | 第26页 |
| 3．4．5 外源蛋白的糖基化 | 第26-27页 |
| 3．5 外源基因在P．pastoris中的高效表达策略 | 第27-31页 |
| 3．5．1 优化表达载体系统 | 第27-28页 |
| 3．5．1．1 载体的选择 | 第27页 |
| 3．5．1．2 选择强启动子 | 第27页 |
| 3．5．1．3 信号肽的选择 | 第27-28页 |
| 3．5．2 增加外源基因整合拷贝数 | 第28-29页 |
| 3．5．3 优化发酵条件，提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量 | 第29-30页 |
| 3．5．4 防止目的蛋白降解 | 第30-31页 |
| 3．6 展望 | 第31页 |
| 4． 本课题立体依据及前景分析 | 第31-32页 |
| 5． 本课题主要研究的内容、目的意义和技术路线 | 第32-34页 |
| 5．1 研究内容 | 第32页 |
| 5．2 研究目的 | 第32页 |
| 5．3 研究意义 | 第32页 |
| 5．4 主要技术路线 | 第32-34页 |
| 第二章 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因的克隆与序列分析 | 第34-44页 |
| 1． 材料与方法 | 第34-38页 |
| 1．1 菌株与质粒 | 第34页 |
| 1．2 培养基 | 第34页 |
| 1．3 培养基及培养条件 | 第34-35页 |
| 1．4 链霉菌染色体 DNA的提取 | 第35页 |
| 1．5 PCR反应引物的设计 | 第35页 |
| 1．6 PCR扩增反应 | 第35-36页 |
| 1．7 琼脂糖凝胶电泳及 DNA片段的回收、纯化 | 第36页 |
| 1．8 连接反应 | 第36页 |
| 1．9 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化反应 | 第36-37页 |
| 1．9．1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 1．9．2 转化反应 | 第37页 |
| 1．10 重组质粒的筛选 | 第37页 |
| 1．11 重组质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| 1．11．1 重组质粒 PCR鉴定 | 第37页 |
| 1．11．2 限制性酶切鉴定重组质粒 | 第37-38页 |
| 1．11．2．1 碱裂解法小量制备质粒 DNA | 第37-38页 |
| 1．11．2．2 限制性核酸内切酶酶切技术 | 第38页 |
| 1．12 DNA测序及限制性酶切图谱的构建 | 第38页 |
| 2． 结果与讨论 | 第38-43页 |
| 2．1 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因克隆 | 第38-39页 |
| 2．2 重组质粒pMD18-T-R2的构建 | 第39页 |
| 2．3 重组质粒 PMD18-T-R2的鉴定 | 第39-40页 |
| 2．4 胞壁质酶 R2基因限制性内切酶分析 | 第40-43页 |
| 3． 小结 | 第43-44页 |
| 第三章 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因在枯草芽孢杆菌中表达的研究 | 第44-57页 |
| 1． 材料和方法 | 第44-48页 |
| 1．1 菌株和质粒载体 | 第44页 |
| 1．2 培养基 | 第44-45页 |
| 1．3 工具酶及生化试剂 | 第45页 |
| 1．5 芽孢杆菌质粒DNA提取 | 第45-47页 |
| 1．5．1 小量快速提取质粒DNA | 第45-46页 |
| 1．5．2 大量提取质粒DNA | 第46-47页 |
| 1．6 枯草芽孢杆菌转化技术 | 第47页 |
| 1．7 溶菌酶酶活测定方法 | 第47-48页 |
| 1．7．1 指示菌悬液的制备 | 第47页 |
| 1．7．2 液体溶菌活性测定 | 第47-48页 |
| 1．8 蛋白含量的测定(采用Bradford法测细胞蛋白含量) | 第48页 |
| 2． 结果与讨论 | 第48-57页 |
| 2．1 枯草芽孢杆菌对卡那霉素的敏感性分析 | 第48-49页 |
| 2．2 枯草芽孢杆菌感受态转化法研究 | 第49-50页 |
| 2．3 重组质粒pMA5-R2和pMA5-R2-a的构建 | 第50页 |
| 2．4 重组质粒转化枯草芽孢杆菌 | 第50-52页 |
| 2．5 N，O-二乙酰胞壁质酶R2基因基因在枯草芽孢杆菌中表达的产酶曲线 | 第52页 |
| 2．6 重组溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第52-53页 |
| 2．7 最适作用温度及热稳定性 | 第53页 |
| 2．8 最适作用pH及pH稳定性 | 第53-54页 |
| 2．9 转化子BCL1050(pMA5-R2-a)发酵条件的研究 | 第54-56页 |
| 2．9．1 最佳碳源的选择 | 第54页 |
| 2．9．2 最佳氮源的选择 | 第54-55页 |
| 2．9．3 最佳培养温度的选择 | 第55页 |
| 2．9．4 最佳通气量的选择 | 第55-56页 |
| 2．10 讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 N，O-二乙酰胞壁质酶R2基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第57-73页 |
| 1． 材料和方法 | 第57-64页 |
| 1．1 菌株和质粒 | 第57-59页 |
| 1．2 工具酶及生化试剂 | 第59页 |
| 1．3 培养基 | 第59页 |
| 1．4 引物设计 | 第59-60页 |
| 1．5 酶切、连接 | 第60页 |
| 1．6 重组子的筛选 | 第60-61页 |
| 1．7 大量制备质粒pPIC9K-R2 | 第61页 |
| 1．8 毕赤酵母的电转化 | 第61-63页 |
| 1．8．1 制备SMD1168感受态细胞 | 第61-62页 |
| 1．8．2 电转化 DNA样品的制备 | 第62页 |
| 1．8．3 电转化 | 第62-63页 |
| 1．9 毕赤酵母转化子的筛选 | 第63页 |
| 1．9．1 筛选his~+Mut~S阳性克隆 | 第63页 |
| 1．9．2 G418筛选高拷贝转化子 | 第63页 |
| 1．10 重组酵母的PCR鉴定 | 第63页 |
| 1．11 重组酵母的诱导表达 | 第63-64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-73页 |
| 2．1 重组表达质粒pPIC9K-R2的构建 | 第64页 |
| 2．2 重组质粒pPIC9-R2双酶切验证 | 第64-66页 |
| 2．3 毕赤酵母的电转化 | 第66页 |
| 2．4 重组酵母 SMD1168-R2的筛选 | 第66-67页 |
| 2．5 含高拷贝溶菌酶基因的毕赤酵母电转化子的快速筛选 | 第67页 |
| 2．6 重组酵母 SMD1168-R2的PCR验证 | 第67-68页 |
| 2．7 重组酵母的诱导表达 | 第68-69页 |
| 2．8 重组胞壁质酶最适作用温度及热稳定性 | 第69-70页 |
| 2．9 重组胞壁质酶最适作用pH及 pH稳定性 | 第70页 |
| 2．10 讨论 | 第70-73页 |
| 小结 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
