| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-13页 |
| 目录 | 第13-20页 |
| 第一章 地黄、山药和大豆遗传多样性的ISSR和RAPD分析 | 第20-83页 |
| 第一节 绪论 | 第20-36页 |
| 1 植物DNA分子标记技术概述 | 第20-24页 |
| 1．1 遗传标记及其类型 | 第20页 |
| 1．2 DNA分子标记的建立和发展 | 第20-22页 |
| 1．3 DNA分子标记的特点 | 第22-23页 |
| 1．4 DNA分子标记技术类型 | 第23-24页 |
| 2 RAPD标记技术 | 第24-31页 |
| 2．1 RAPD标记技术的概念和原理 | 第24-25页 |
| 2．2 RAPD标记技术的特点 | 第25-26页 |
| 2．3 RAPD标记技术操作 | 第26页 |
| 2．4 PAPD标记技术在植物学研究中的应用 | 第26-31页 |
| 2．4．1 遗传图谱的构建 | 第27页 |
| 2．4．2 系统进化发育 | 第27-28页 |
| 2．4．3 基因定位 | 第28页 |
| 2．4．4 在植物分子标记辅助育种选择中的应用 | 第28-30页 |
| 2．4．5 作物品种鉴定和杂交种纯度鉴定 | 第30页 |
| 2．4．6 体细胞杂种的鉴定 | 第30-31页 |
| 2．4．7 性别鉴定 | 第31页 |
| 3 ISSR标记技术 | 第31-36页 |
| 3．1 ISSR标记技术概述 | 第31-32页 |
| 3．2 ISSR标记技术的原理 | 第32-33页 |
| 3．3 ISSR标记技术的特点 | 第33页 |
| 3．4 ISSR标记技术的操作步骤 | 第33-34页 |
| 3．5 ISSR标记技术的应用 | 第34-36页 |
| 3．5．1 遗传连锁图谱的构建 | 第34页 |
| 3．5．2 基因定位 | 第34页 |
| 3．5．3 种质资源鉴定 | 第34页 |
| 3．5．4 植物亲缘关系分析 | 第34-36页 |
| 第二节 地黄、山药和大豆遗传多样性的RAPD与ISSR分析 | 第36-83页 |
| 1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义 | 第36-39页 |
| 1．1 地黄 | 第36-37页 |
| 1．2 山药 | 第37-38页 |
| 1．3 大豆 | 第38-39页 |
| 2 实验材料 | 第39-41页 |
| 2．1 地黄幼叶 | 第39-40页 |
| 2．2 山药幼叶 | 第40页 |
| 2．3 大豆下胚轴 | 第40-41页 |
| 3 实验方法 | 第41-48页 |
| 3．1 基因组DNA的提取、纯化和检测 | 第41-42页 |
| 3．1．1 地黄基因组 DNA的提取、纯化和检测 | 第41-42页 |
| 3．1．2 山药基因组 DNA的提取、纯化和检测 | 第42页 |
| 3．1．3 大豆基因组 DNA的提取、纯化和检测 | 第42页 |
| 3．2 ISSR标记和RAPD标记及其产物检测 | 第42-47页 |
| 3．2．1 地黄ISSR标记和RAPD标记及其产物检测 | 第42-45页 |
| 3．2．2 山药ISSR标记和RAPD标记及其产物检测 | 第45-46页 |
| 3．2．3 大豆ISSR标记及其产物检测 | 第46-47页 |
| 3．3 数据统计与分析 | 第47-48页 |
| 4 结果和分析 | 第48-76页 |
| 4．1 基因组 DNA的提取与检测 | 第48-51页 |
| 4．2 ISSR-PCR扩增产物的多态性 | 第51-65页 |
| 4．2．1 地黄ISSR-PCR扩增产物的多态性 | 第51-59页 |
| 4．2．2 山药ISSR-PCR扩增产物的多态性 | 第59-62页 |
| 4．2．3 大豆ISSR-PCR扩增产物的多态性 | 第62-65页 |
| 4．3 ISSR聚类分析 | 第65-67页 |
| 4．3．1 地黄品种间的ISSR聚类分析 | 第65页 |
| 4．3．2 山药品种间的ISSR聚类分析 | 第65-66页 |
| 4．3．3 大豆品种间的ISSR聚类分析 | 第66-67页 |
| 4．4 基于ISSR标记的主成分分析 | 第67-69页 |
| 4．4．1 地黄品种基于ISSR标记的主成分分析 | 第67-68页 |
| 4．4．2 山药品种基于ISSR标记的主成分分析 | 第68页 |
| 4．4．3 大豆品种基于ISSR标记的主成分分析 | 第68-69页 |
| 4．5 RAPD-PCR扩增产物的多态性 | 第69-73页 |
| 4．5．1 地黄RAPD-PCR扩增产物的多态性 | 第69-72页 |
| 4．5．2 山药RAPD-PCR扩增产物的多态性 | 第72-73页 |
| 4．6 地黄品种间的RAPD聚类分析 | 第73-76页 |
| 4．7 地黄RAPD和ISSR标记的相关分析 | 第76页 |
| 5 讨论 | 第76-83页 |
| 5．1 三种植物基因组 DNA的提取方法及其改良 | 第76-77页 |
| 5．2 三种植物遗传多样性评价 | 第77-79页 |
| 5．3 地黄遗传相似性评价 | 第79-80页 |
| 5．4 反应体系的稳定性和可重复性 | 第80页 |
| 5．5 一些值得注意的实验技术问题及其解决方法 | 第80-83页 |
| 第二章 农杆菌介导的怀地黄和大豆遗传转化 | 第83-142页 |
| 第一节 农杆菌介导的遗传转化研究进展 | 第83-92页 |
| 1 农杆菌转化系统 | 第83-84页 |
| 2 农杆菌及其质粒 | 第84-85页 |
| 3 农杆菌转化植物细胞的机理 | 第85-87页 |
| 4 农杆菌载体系统 | 第87-89页 |
| 5 农杆菌转化系统的优缺点 | 第89-90页 |
| 5．1 农杆菌转化系统的优点 | 第89页 |
| 5．2 农杆菌转化系统的缺点 | 第89-90页 |
| 6 影响转基因表达的主要因素 | 第90-91页 |
| 7 农杆菌介导的植物遗传转化应用 | 第91-92页 |
| 第二节 发根农杆菌对怀地黄的转化及毛状根的植株再生 | 第92-123页 |
| 1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义 | 第92-94页 |
| 2 实验材料 | 第94页 |
| 2．1 植物材料 | 第94页 |
| 2．2 发根农杆菌菌株 | 第94页 |
| 3 实验方法 | 第94-100页 |
| 3．1 无菌外植体的获得 | 第94页 |
| 3．2 发根农杆菌菌株菌液的制备 | 第94-95页 |
| 3．3 转化试验 | 第95页 |
| 3．3．1 不同菌株对叶片转化率的影响 | 第95页 |
| 3．3．2 不同外植体对转化率的影响 | 第95页 |
| 3．4 毛状根离体培养系的建立 | 第95-96页 |
| 3．5 毛状根的鉴定 | 第96-97页 |
| 3．5．1 PCR检测 | 第96-97页 |
| 3．5．2 冠瘿碱检测 | 第97页 |
| 3．6 不同培养基对毛状根生长的影响 | 第97页 |
| 3．7 不同培养方法对毛状根生长的影响 | 第97-98页 |
| 3．8 不同蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响 | 第98页 |
| 3．9 HPLC测定梓醇 | 第98-99页 |
| 3．9．1 对照标准品溶液的制备 | 第98页 |
| 3．9．2 样品溶液的制备 | 第98-99页 |
| 3．9．3 测定条件 | 第99页 |
| 3．10 愈伤组织的诱导 | 第99页 |
| 3．11 6-BA和GA_3对愈伤组织分化芽的影响 | 第99页 |
| 3．12 GA_3、KT和6-BA对毛状根直接分化芽的影响 | 第99页 |
| 3．13 生根和转化植物的鉴定 | 第99页 |
| 3．14 再生转化植株形态、气孔和叶绿体观擦 | 第99页 |
| 3．15 移栽 | 第99-100页 |
| 4 实验结果 | 第100-117页 |
| 4．1 怀地黄85-5芽的快速繁殖 | 第100页 |
| 4．2 不同菌株对叶外植体毛状根诱导率的影响 | 第100-101页 |
| 4．3 不同外植体对毛状根诱导率的影响 | 第101-103页 |
| 4．4 毛状根克隆系的建立 | 第103-104页 |
| 4．5 毛状根的PCR检测 | 第104-105页 |
| 4．6 毛状根冠瘿碱的检测 | 第105-106页 |
| 4．7 不同培养基对毛状根生长的影响 | 第106页 |
| 4．8 不同培养方法对毛状根生长的影响 | 第106-107页 |
| 4．9 蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响 | 第107-109页 |
| 4．9．1 回归方程的建立和相关系数的计算 | 第107-108页 |
| 4．9．2 鲜地黄、生地黄和组培苗根的梓醇含量 | 第108页 |
| 4．9．3 蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响结果 | 第108-109页 |
| 4．10 2，4-D和6-BA组合对毛状根愈伤组织诱导的影响作用 | 第109-111页 |
| 4．11 植物生长调节剂对毛状根分化芽的影响 | 第111-113页 |
| 4．11．1 GA_3和6-BA组合对毛状根愈伤组织分化芽的影响作用 | 第111-112页 |
| 4．11．2 GA_3、KT和6-BA组合对毛状根直接分化芽的影响作用 | 第112-113页 |
| 4．12 转化芽生根 | 第113页 |
| 4．13 再生转化植株的鉴定 | 第113-114页 |
| 4．13．1 PCR检测 | 第113-114页 |
| 4．13．2 冠瘿碱检测 | 第114页 |
| 4．14 再生转化植株的形态观察 | 第114页 |
| 4．15 气孔和叶绿体观察 | 第114-116页 |
| 4．16 移栽 | 第116-117页 |
| 5 讨论 | 第117-123页 |
| 5．1 怀地黄毛状根的诱导和鉴定 | 第117-118页 |
| 5．2 影响发根农杆菌转化植物细胞的因素 | 第118-121页 |
| 5．3 rol基因与植物激素互作影响植物细胞分化和植株再生 | 第121页 |
| 5．4 毛状根及其产生的组织、器官和植物的鉴定方法 | 第121-123页 |
| 第三节 大豆fad基因片段的克隆及其对根癌农杆菌的转化 | 第123-142页 |
| 1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义 | 第123-125页 |
| 2 实验材料 | 第125-126页 |
| 2．1 植物材料 | 第125页 |
| 2．2 载体、菌株与抗生素 | 第125页 |
| 2．3 试剂 | 第125-126页 |
| 2．3．1 酶及试剂盒 | 第125-126页 |
| 2．3．2 DNA提取所用溶液 | 第126页 |
| 2．3．3 根癌农杆菌质粒提取的试剂 | 第126页 |
| 2．3．4 LB培养基 | 第126页 |
| 2．3．5 YEB培养基 | 第126页 |
| 3 实验方法 | 第126-133页 |
| 3．1 总DNA的提取 | 第126页 |
| 3．2 PCR方法分离fad2-1基因片段 | 第126-128页 |
| 3．2．1 引物的设计 | 第126-127页 |
| 3．2．2 PCR扩增 | 第127页 |
| 3．2．3 PCR产物的纯化 | 第127-128页 |
| 3．3 大肠杆菌转化和转化子鉴定 | 第128-130页 |
| 3．3．1 连接 | 第128页 |
| 3．3．2 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第128-129页 |
| 3．3．3 转化E．coli JM109 | 第129页 |
| 3．3．4 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第129-130页 |
| 3．3．5 大肠杆菌转化子酶切鉴定 | 第130页 |
| 3．3．6 大肠杆菌转化子PCR鉴定 | 第130页 |
| 3．4 DNA序列测定和分析 | 第130页 |
| 3．5 反义基因表达载体的构建 | 第130-131页 |
| 3．6 根癌农杆菌转化和转化子鉴定 | 第131-133页 |
| 3．6．1 反义表达载体pbt-pfad质粒的提取及纯化 | 第131页 |
| 3．6．2 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备 | 第131页 |
| 3．6．3 转化 | 第131-132页 |
| 3．6．4 根癌农杆菌质粒的提取 | 第132-133页 |
| 3．6．5 根癌农杆菌转化子的双酶切鉴定 | 第133页 |
| 3．6．6 质粒的PCR检测 | 第133页 |
| 4 实验结果 | 第133-138页 |
| 4．1 总DNA的提取 | 第133页 |
| 4．2 目的基因的克隆 | 第133页 |
| 4．3 重组质粒的PCR检测和酶切检测 | 第133-134页 |
| 4．4 大豆fad2-1基因部分序列的测定及分析 | 第134-135页 |
| 4．5 植物反义表达载体的构建及酶切和PCR检测 | 第135-137页 |
| 4．6 根癌农杆菌转化子鉴定 | 第137-138页 |
| 5 讨论 | 第138-142页 |
| 5．1 PCR法克隆大豆油脂酰-△-12去饱和酶基因fad2-1 | 第138-139页 |
| 5．2 反义fad2-1基因片段表达载体的构建 | 第139-140页 |
| 5．3 选定合适的克隆载体 | 第140页 |
| 5．4 质粒DNA的质量和纯度影响根癌农杆菌LBA4404转化 | 第140-142页 |
| 结论 | 第142-144页 |
| 本研究的创新点 | 第144-145页 |
| 研究有待进一步解决的问题 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-162页 |
| 攻读博士学位期间科研成果和奖励 | 第162-163页 |
| 附件 | 第163-167页 |
| 致谢 | 第167页 |
