| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 文献综述 | 第12-28页 |
| 1 植酸酶及植酸酶的研究应用 | 第12-19页 |
| ·植酸酶的定义及作用底物的机制 | 第12页 |
| ·植酸酶的生物学特性 | 第12-13页 |
| ·植酸酶基因 | 第13-14页 |
| ·植酸酶基因工程 | 第14-15页 |
| ·植酸酶的应用 | 第15-17页 |
| ·植酸酶在饲料工业中的应用 | 第15-16页 |
| ·植酸酶在食品工业中的应用 | 第16-17页 |
| ·国内外植酸酶开发研究的现状及发展趋势 | 第17-19页 |
| ·植酸酶基因在微生物中的表达 | 第17-19页 |
| ·在原核生物中表达 | 第17-18页 |
| ·在真核微生物中表达 | 第18-19页 |
| ·植酸酶研究的发展方向 | 第19页 |
| 2 本项研究的目的意义 | 第19-21页 |
| ·意义 | 第19-20页 |
| ·现状与问题 | 第20页 |
| ·实验目的 | 第20-21页 |
| 3 酵母外源基因表达系统研究进展 | 第21-28页 |
| ·酿酒酵母外源基因表达系统 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母外源基因表达系统 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优点 | 第22页 |
| ·毕赤酵母表达宿主 | 第22-23页 |
| ·甲醇代谢 | 第23页 |
| ·三种常用表达宿主菌 | 第23页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第23-24页 |
| ·整合的方式 | 第24-25页 |
| ·转化方法 | 第25-26页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素及优化策略 | 第26-28页 |
| ·外源基因特性 | 第26页 |
| ·表达框的染色体整合位点 | 第26页 |
| ·宿主菌的甲醇利用表型 | 第26页 |
| ·基因剂量 | 第26页 |
| ·启动子 | 第26-27页 |
| ·分泌信号 | 第27页 |
| ·产物稳定性 | 第27页 |
| ·翻译后修饰 | 第27页 |
| ·发酵条件 | 第27-28页 |
| 材料与方法 | 第28-44页 |
| 1 实验材料 | 第28-32页 |
| ·菌株与质粒 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28-30页 |
| ·酶与试剂 | 第30页 |
| ·引物 | 第30页 |
| ·RNA提取液及常用贮液 | 第30-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-44页 |
| ·酸性植酸酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第32-37页 |
| ·丝状真菌黑曲霉总DNA提取 | 第32-33页 |
| ·PCR引物合成和基因扩增 | 第33页 |
| ·DNA克隆 | 第33页 |
| ·重组质粒pPIC9K-PhyB的构建 | 第33-34页 |
| ·基因替换型整合转化酵母细胞 | 第34-36页 |
| ·基因插入型整合转化酵母细胞 | 第36-37页 |
| ·丝状真菌黑曲霉总RNA的提取 | 第37-38页 |
| ·菌株及培养收集 | 第37页 |
| ·RNA提取方法相比较 | 第37-38页 |
| ·RT-PCR及植酸酶基因扩增 | 第38-39页 |
| ·酸性植酸酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第39-44页 |
| ·cDNA快速纯化、回收 | 第39-40页 |
| ·cDNA克隆入T载体 | 第40页 |
| ·E.coli及转化质粒的提取 | 第40-41页 |
| ·质粒酶切，回收线性片段 | 第41页 |
| ·酶切连有带信号肽基因的T载体 | 第41页 |
| ·连接反应 | 第41页 |
| ·大肠杆菌(E.coli DH5a)感受态细胞制备方法 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌转化方法(E.coli DH5a) | 第42页 |
| ·在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达的方法 | 第42页 |
| ·细胞的裂解 | 第42页 |
| ·植酸酶活力测定原理及方法 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第43页 |
| ·凝胶染色与脱色 | 第43-44页 |
| 实验结果 | 第44-59页 |
| 1 丝状真菌总DNA的提取 | 第44页 |
| 2 酸性植酸酶基因在毕赤酵母细胞中的表达 | 第44-50页 |
| ·重组质粒pPIC9K-PhyB的构建及鉴定 | 第44-47页 |
| ·基因替换型整合转化酵母细胞 | 第47-49页 |
| ·基因插入型整合转化酵母细胞 | 第49-50页 |
| 3 丝状真菌总RNA的提取 | 第50页 |
| 4 酸性植酸酶基因扩增 | 第50-54页 |
| ·RT-PCR | 第50-51页 |
| ·DNA及cDNA克隆入T载体 | 第51-52页 |
| ·酸性植酸酶序列测定 | 第52-54页 |
| 5 酸性植酸酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第54-59页 |
| ·重组质粒pBV220-PhyB的构建及鉴定 | 第54-56页 |
| ·将重组质粒诱导表达及表达产物检测 | 第56页 |
| ·表达产物酶学性质与出发菌株所产酶学性质比较研究 | 第56-59页 |
| 小结、讨论与下一步工作设想 | 第59-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 发表文章 | 第68页 |