| 中文摘要 | 第1-17页 |
| 缩略词 | 第17-19页 |
| 前言 | 第19-46页 |
| 1 果树病毒的危害及特点 | 第19-21页 |
| 2 病毒病的研究概况 | 第21-26页 |
| 3 果树病毒病的检测技术 | 第26-46页 |
| ·外观症状诊断法 | 第26页 |
| ·指示植物检测法 | 第26-27页 |
| ·电子显微镜检测 | 第27页 |
| ·血清学检测法 | 第27-28页 |
| ·分子生物学检测法 | 第28-43页 |
| ·核酸分子杂交技术 | 第29-32页 |
| ·多聚酶链式反应技术 | 第32-36页 |
| ·双链RNA技术 | 第36-38页 |
| ·原位PCR技术 | 第38-43页 |
| 4 我国果树病毒病的研究存在的问题和发展趋势 | 第43-46页 |
| 第一部分:葡萄主要病毒 RT-PCR 检测技术研究 | 第46-70页 |
| 1 材料和方法 | 第46-50页 |
| ·供试材料 | 第46页 |
| ·供试试剂 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-50页 |
| ·总RNA的提取方法 | 第47-48页 |
| ·总RNA的纯化 | 第48页 |
| ·总 RNA 完整性和含量检测 | 第48页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 有效RT-PCR 体系的建立 | 第48-49页 |
| ·GLRaV、GFLV RT-PCR 体系的优化 | 第49页 |
| ·PCR 产物的电泳分析 | 第49页 |
| ·葡萄样品的带毒情况测定 | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-68页 |
| ·葡萄组织中总RNA完整性检测 | 第50-51页 |
| ·葡萄组织中总 RNA 的纯度 | 第51-52页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 有效 RT-PCR 体系的建立 | 第52-53页 |
| ·GLRaV Ⅲ有效 RT-PCR 体系 | 第52页 |
| ·GFLV 有效RT-PCR 体系 | 第52-53页 |
| ·GLRaV RT-PCR 体系优化 | 第53-60页 |
| ·RT 成分和时间对 GLRaV Ⅲ RT 的影响 | 第53-57页 |
| ·GLRaV Ⅲ PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响 | 第57-60页 |
| ·GLRaV Ⅲ RT-PCR 优化体系 | 第60页 |
| ·GFLV RT—PCR 体系优化 | 第60-64页 |
| ·RT 主要成分对GFLV RT 的影响 | 第60-61页 |
| ·GFLV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响 | 第61-64页 |
| ·GFLV RT-PCR 的优化体系 | 第64页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR | 第64-68页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 体系的建立 | 第64-65页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重RT-PCR 体系优化分析 | 第65-67页 |
| ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 优化体系 | 第67-68页 |
| ·样品带毒率检测结果 | 第68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| ·关于总RNA 及dsRNA 的提取 | 第68页 |
| ·PCR 反应的优化与设计 | 第68-69页 |
| ·关于多重 RT-PCR | 第69-70页 |
| 第二部分:库尔勒香梨主要病毒 RT-PCR 检测技术研究 | 第70-114页 |
| 1 材料与方法 | 第70-83页 |
| ·材料 | 第70页 |
| ·供试材料 | 第70页 |
| ·菌株 | 第70页 |
| ·质粒 | 第70页 |
| ·供试试剂 | 第70-72页 |
| ·试剂和酶类 | 第70-71页 |
| ·引物 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-83页 |
| ·RT-PCR 的实验方法 | 第72-75页 |
| ·总 RNA 提取方法 | 第72-73页 |
| ·dsRNA 提取方法 | 第73页 |
| ·总RNA的纯化 | 第73页 |
| ·dsRNA、总 RNA 含量、纯度和完整性检测 | 第73-74页 |
| ·PVYV(ASPV)、ACLSV 有效 RT-PCR 体系的建立 | 第74页 |
| ·PVYV(ASPV)、ACLSV RT-PCR 体系的优化 | 第74页 |
| ·PCR 产物的电泳分析 | 第74-75页 |
| ·内标多重 RT-PCR 实验方法 | 第75-83页 |
| ·梨组织中总RNA的提取 | 第75-76页 |
| ·梨组织中总核酸的提取 | 第76-77页 |
| ·库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系 | 第77-78页 |
| ·库尔勒香梨病毒多重RT-PCR检测体系的建立 | 第78-79页 |
| ·目的基因转化大肠杆菌 | 第79-82页 |
| ·序列测定与分析 | 第82-83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-109页 |
| ·dsRNA、总RNA 的纯度和浓度 | 第83页 |
| ·总 RNA、dsRNA 的电泳检测 | 第83-85页 |
| ·梨组织总核酸的提取 | 第85-86页 |
| ·dsRNA、总RNA RT-PCR 活性检验 | 第86-87页 |
| ·PVYV(ASPV)和 ACLSV dsRNA、总 RNA RT-PCR 有效体系 | 第87-88页 |
| ·PVYV(ASPV)dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系 | 第87-88页 |
| ·ACLSV dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系 | 第88页 |
| ·PVYV RT-PCR 体系的优化 | 第88-97页 |
| ·RT 成分浓度对PVYV RT 的影响 | 第88-93页 |
| ·PVYV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响 | 第93-96页 |
| ·PVYV(ASPV) RT-PCR 优化体系 | 第96-97页 |
| ·ACLSV RT-PCR 检测方法的优化 | 第97-100页 |
| ·RT 成分浓度对ACLSV RT 的影响 | 第97-98页 |
| ·ACLSV PCR 检测各反应成分的的浓度对PCR 扩增的影响 | 第98-100页 |
| ·ACLSV RT-PCR 优化体系 | 第100页 |
| ·库尔勒香梨病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立 | 第100-104页 |
| ·库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系 | 第100-101页 |
| ·内标体系的建立 | 第101-103页 |
| ·多重 RT-PCR 体系 | 第103-104页 |
| ·RT-PCR 产物的转化、筛选和鉴定 | 第104-106页 |
| ·目的片段的序列分析与比较 | 第106-109页 |
| 3 讨论 | 第109-114页 |
| ·关于总 RNA 的提取 | 第109-111页 |
| ·PCR 体系的建立和优化 | 第111-112页 |
| ·库尔勒香梨病毒的多重 RT-PCR 检测体系 | 第112-114页 |
| 第三部分:库尔勒香梨主要病毒cDNA 探针检测技术研究 | 第114-132页 |
| 1 材料和方法 | 第114-118页 |
| ·供试材料 | 第114页 |
| ·供试试剂 | 第114-115页 |
| ·实验方法 | 第115-118页 |
| ·总RNA提取方法 | 第115-116页 |
| ·总 RNA 的纯化 | 第116页 |
| ·总RNA 含量、纯度和完整性检测 | 第116页 |
| ·ASPV、ACLSV 生物素标记的cDNA 探针的合成 | 第116-117页 |
| ·探针显色灵敏度的检测 | 第117页 |
| ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立 | 第117-118页 |
| ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测体系的优化 | 第118页 |
| ·对不同样品检测效果比较 | 第118页 |
| ·不同杂交膜比较 | 第118页 |
| ·不同封闭剂对杂交信号检测影响 | 第118页 |
| ·田间样品的带毒情况检测 | 第118页 |
| 2 结果与分析 | 第118-129页 |
| ·总 RNA 的纯度和浓度 | 第118-119页 |
| ·总 RNA 的完整性 | 第119页 |
| ·生物素标记的标记cDNA 探针的鉴定 | 第119-121页 |
| ·ASPV cDNA 探针电泳鉴定 | 第119-120页 |
| ·ACLSV cDNA 探针电泳鉴定 | 第120-121页 |
| ·ASPV、ACLSV 生物素标记探针显色灵敏度的检测 | 第121页 |
| ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立 | 第121-122页 |
| ·ASPV 斑点杂交检测体系的优化 | 第122-124页 |
| ·反应温度对ASPV斑点杂交反应的影响 | 第122页 |
| ·反应时间对ASPV斑点杂交反应的影响 | 第122-123页 |
| ·探针浓度对ASPV斑点杂交反应的影响 | 第123-124页 |
| ·甲酰胺浓度对ASPV斑点杂交反应的影响 | 第124页 |
| ·ACLSV 斑点杂交检测体系的优化 | 第124-127页 |
| ·反应温度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响 | 第124-125页 |
| ·反应时间对 ACLSV 斑点杂交反应的影响 | 第125页 |
| ·探针浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响 | 第125-126页 |
| ·甲酰胺浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响 | 第126-127页 |
| ·不同组织和提取方法对病毒检测效果的影响 | 第127-128页 |
| ·不同组织和提取方法对ASPV检测效果的影响 | 第127页 |
| ·不同组织和提取方法对 ACLSV 检测效果的影响 | 第127-128页 |
| ·不同杂交膜对杂交检测效果影响 | 第128页 |
| ·不同封闭剂对杂交检测效果影响 | 第128-129页 |
| ·样品检测结果 | 第129页 |
| 3 讨论 | 第129-132页 |
| ·斑点杂交检测优化体系的建立和优化 | 第129-130页 |
| ·cDNA 探针检测的可靠性和灵敏度 | 第130-131页 |
| ·生物素标记的cDNA探针的应用 | 第131-132页 |
| 第四部分:应用原位 RT-PCR 技术检测果树病毒的方法学研究 | 第132-147页 |
| 1 材料和方法 | 第132-135页 |
| ·供试材料 | 第132页 |
| ·试剂 | 第132-133页 |
| ·试验方法 | 第133-135页 |
| ·石蜡切片制作 | 第133页 |
| ·切片预处理 | 第133页 |
| ·cDNA 合成 | 第133-134页 |
| ·原位扩增 | 第134页 |
| ·原位 PCR 产物的免疫检测 | 第134页 |
| ·对照的设置 | 第134-135页 |
| ·不同预处理效果研究 | 第135页 |
| ·果胶酶处理时间对原位切片效果的影响 | 第135页 |
| ·蛋白酶处理时间原位切片效果的影响 | 第135页 |
| ·碱性磷酸酶显色系统可靠性实验 | 第135页 |
| ·PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果研究 | 第135页 |
| ·有效RT反应体系的建立 | 第135页 |
| ·扩增中各因素对试验结果影响的研究 | 第135页 |
| 2 结果与分析 | 第135-144页 |
| ·预处理对原位切片效果的影响 | 第135-136页 |
| ·果胶酶处理时间的影响 | 第135-136页 |
| ·蛋白酶处理时间的影响 | 第136页 |
| ·碱性磷酸酶显色系统可靠性实验结果 | 第136-137页 |
| ·PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果 | 第137页 |
| ·苹果褪绿叶斑病毒在组织中的分布 | 第137-138页 |
| ·RT 组分浓度对原位PCR 效果的影响 | 第138-140页 |
| ·RNasin 浓度的影响 | 第138页 |
| ·dNTPs 浓度对扩增效果的影响 | 第138-139页 |
| ·AMV 浓度对 RT 效果的影响 | 第139-140页 |
| ·引物浓度对结果的影响 | 第140页 |
| ·原位扩增中各因素对 PCR 效果的影响 | 第140-144页 |
| ·退火温度对 PCR 的影响 | 第140-141页 |
| ·循环次数对原位 PCR 效果的影响 | 第141-142页 |
| ·引物浓度对原位 PCR 效果的影响 | 第142页 |
| ·Taq 浓度对 PCR 的影响 | 第142-143页 |
| ·Mg~(2+)量对原位PCR效果的影响 | 第143-144页 |
| 3 讨论 | 第144-147页 |
| ·固定剂的选用与固定时间的确定 | 第144页 |
| ·蛋白酶消化时间的确定 | 第144-145页 |
| ·地高辛标记核苷酸的使用 | 第145页 |
| ·原位 PCR 的反应体系各组分对结果的影响 | 第145-146页 |
| ·原位 PCR 检测梨病毒的敏感性与特异性 | 第146-147页 |
| 结论 | 第147-148页 |
| 参考文献 | 第148-158页 |
| 附录 | 第158-166页 |
| 英文摘要 | 第166-169页 |
| 攻读博士学位论文期间发表的文章目录 | 第169-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
| 论文图表统计 | 第172页 |
