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库尔勒香梨和葡萄病毒分子检测技术研究

中文摘要第1-17页
缩略词第17-19页
前言第19-46页
 1 果树病毒的危害及特点第19-21页
 2 病毒病的研究概况第21-26页
 3 果树病毒病的检测技术第26-46页
   ·外观症状诊断法第26页
   ·指示植物检测法第26-27页
   ·电子显微镜检测第27页
   ·血清学检测法第27-28页
   ·分子生物学检测法第28-43页
     ·核酸分子杂交技术第29-32页
     ·多聚酶链式反应技术第32-36页
     ·双链RNA技术第36-38页
     ·原位PCR技术第38-43页
  4 我国果树病毒病的研究存在的问题和发展趋势第43-46页
第一部分:葡萄主要病毒 RT-PCR 检测技术研究第46-70页
 1 材料和方法第46-50页
   ·供试材料第46页
   ·供试试剂第46-47页
   ·实验方法第47-50页
     ·总RNA的提取方法第47-48页
     ·总RNA的纯化第48页
     ·总 RNA 完整性和含量检测第48页
     ·GLRaV Ⅲ、GFLV 有效RT-PCR 体系的建立第48-49页
     ·GLRaV、GFLV RT-PCR 体系的优化第49页
     ·PCR 产物的电泳分析第49页
     ·葡萄样品的带毒情况测定第49-50页
 2 结果与分析第50-68页
   ·葡萄组织中总RNA完整性检测第50-51页
   ·葡萄组织中总 RNA 的纯度第51-52页
   ·GLRaV Ⅲ、GFLV 有效 RT-PCR 体系的建立第52-53页
     ·GLRaV Ⅲ有效 RT-PCR 体系第52页
     ·GFLV 有效RT-PCR 体系第52-53页
   ·GLRaV RT-PCR 体系优化第53-60页
     ·RT 成分和时间对 GLRaV Ⅲ RT 的影响第53-57页
     ·GLRaV Ⅲ PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响第57-60页
     ·GLRaV Ⅲ RT-PCR 优化体系第60页
   ·GFLV RT—PCR 体系优化第60-64页
     ·RT 主要成分对GFLV RT 的影响第60-61页
     ·GFLV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响第61-64页
     ·GFLV RT-PCR 的优化体系第64页
   ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR第64-68页
     ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 体系的建立第64-65页
     ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重RT-PCR 体系优化分析第65-67页
     ·GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 优化体系第67-68页
   ·样品带毒率检测结果第68页
 3 讨论第68-70页
   ·关于总RNA 及dsRNA 的提取第68页
   ·PCR 反应的优化与设计第68-69页
   ·关于多重 RT-PCR第69-70页
第二部分:库尔勒香梨主要病毒 RT-PCR 检测技术研究第70-114页
 1 材料与方法第70-83页
   ·材料第70页
     ·供试材料第70页
     ·菌株第70页
     ·质粒第70页
   ·供试试剂第70-72页
     ·试剂和酶类第70-71页
     ·引物第71-72页
   ·实验方法第72-83页
     ·RT-PCR 的实验方法第72-75页
       ·总 RNA 提取方法第72-73页
       ·dsRNA 提取方法第73页
       ·总RNA的纯化第73页
       ·dsRNA、总 RNA 含量、纯度和完整性检测第73-74页
       ·PVYV(ASPV)、ACLSV 有效 RT-PCR 体系的建立第74页
       ·PVYV(ASPV)、ACLSV RT-PCR 体系的优化第74页
       ·PCR 产物的电泳分析第74-75页
     ·内标多重 RT-PCR 实验方法第75-83页
       ·梨组织中总RNA的提取第75-76页
       ·梨组织中总核酸的提取第76-77页
       ·库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系第77-78页
       ·库尔勒香梨病毒多重RT-PCR检测体系的建立第78-79页
       ·目的基因转化大肠杆菌第79-82页
       ·序列测定与分析第82-83页
 2 结果与分析第83-109页
   ·dsRNA、总RNA 的纯度和浓度第83页
   ·总 RNA、dsRNA 的电泳检测第83-85页
   ·梨组织总核酸的提取第85-86页
   ·dsRNA、总RNA RT-PCR 活性检验第86-87页
   ·PVYV(ASPV)和 ACLSV dsRNA、总 RNA RT-PCR 有效体系第87-88页
     ·PVYV(ASPV)dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系第87-88页
     ·ACLSV dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系第88页
   ·PVYV RT-PCR 体系的优化第88-97页
     ·RT 成分浓度对PVYV RT 的影响第88-93页
     ·PVYV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响第93-96页
     ·PVYV(ASPV) RT-PCR 优化体系第96-97页
   ·ACLSV RT-PCR 检测方法的优化第97-100页
     ·RT 成分浓度对ACLSV RT 的影响第97-98页
     ·ACLSV PCR 检测各反应成分的的浓度对PCR 扩增的影响第98-100页
     ·ACLSV RT-PCR 优化体系第100页
   ·库尔勒香梨病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立第100-104页
     ·库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系第100-101页
     ·内标体系的建立第101-103页
     ·多重 RT-PCR 体系第103-104页
   ·RT-PCR 产物的转化、筛选和鉴定第104-106页
   ·目的片段的序列分析与比较第106-109页
 3 讨论第109-114页
   ·关于总 RNA 的提取第109-111页
   ·PCR 体系的建立和优化第111-112页
   ·库尔勒香梨病毒的多重 RT-PCR 检测体系第112-114页
第三部分:库尔勒香梨主要病毒cDNA 探针检测技术研究第114-132页
 1 材料和方法第114-118页
   ·供试材料第114页
   ·供试试剂第114-115页
   ·实验方法第115-118页
     ·总RNA提取方法第115-116页
     ·总 RNA 的纯化第116页
     ·总RNA 含量、纯度和完整性检测第116页
     ·ASPV、ACLSV 生物素标记的cDNA 探针的合成第116-117页
     ·探针显色灵敏度的检测第117页
     ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立第117-118页
     ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测体系的优化第118页
     ·对不同样品检测效果比较第118页
     ·不同杂交膜比较第118页
     ·不同封闭剂对杂交信号检测影响第118页
     ·田间样品的带毒情况检测第118页
 2 结果与分析第118-129页
   ·总 RNA 的纯度和浓度第118-119页
   ·总 RNA 的完整性第119页
   ·生物素标记的标记cDNA 探针的鉴定第119-121页
     ·ASPV cDNA 探针电泳鉴定第119-120页
     ·ACLSV cDNA 探针电泳鉴定第120-121页
   ·ASPV、ACLSV 生物素标记探针显色灵敏度的检测第121页
   ·ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立第121-122页
   ·ASPV 斑点杂交检测体系的优化第122-124页
     ·反应温度对ASPV斑点杂交反应的影响第122页
     ·反应时间对ASPV斑点杂交反应的影响第122-123页
     ·探针浓度对ASPV斑点杂交反应的影响第123-124页
     ·甲酰胺浓度对ASPV斑点杂交反应的影响第124页
   ·ACLSV 斑点杂交检测体系的优化第124-127页
     ·反应温度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响第124-125页
     ·反应时间对 ACLSV 斑点杂交反应的影响第125页
     ·探针浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响第125-126页
     ·甲酰胺浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响第126-127页
   ·不同组织和提取方法对病毒检测效果的影响第127-128页
     ·不同组织和提取方法对ASPV检测效果的影响第127页
     ·不同组织和提取方法对 ACLSV 检测效果的影响第127-128页
   ·不同杂交膜对杂交检测效果影响第128页
   ·不同封闭剂对杂交检测效果影响第128-129页
   ·样品检测结果第129页
 3 讨论第129-132页
   ·斑点杂交检测优化体系的建立和优化第129-130页
   ·cDNA 探针检测的可靠性和灵敏度第130-131页
   ·生物素标记的cDNA探针的应用第131-132页
第四部分:应用原位 RT-PCR 技术检测果树病毒的方法学研究第132-147页
 1 材料和方法第132-135页
   ·供试材料第132页
   ·试剂第132-133页
   ·试验方法第133-135页
     ·石蜡切片制作第133页
     ·切片预处理第133页
     ·cDNA 合成第133-134页
     ·原位扩增第134页
     ·原位 PCR 产物的免疫检测第134页
     ·对照的设置第134-135页
   ·不同预处理效果研究第135页
     ·果胶酶处理时间对原位切片效果的影响第135页
     ·蛋白酶处理时间原位切片效果的影响第135页
   ·碱性磷酸酶显色系统可靠性实验第135页
   ·PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果研究第135页
   ·有效RT反应体系的建立第135页
   ·扩增中各因素对试验结果影响的研究第135页
 2 结果与分析第135-144页
   ·预处理对原位切片效果的影响第135-136页
     ·果胶酶处理时间的影响第135-136页
     ·蛋白酶处理时间的影响第136页
   ·碱性磷酸酶显色系统可靠性实验结果第136-137页
   ·PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果第137页
   ·苹果褪绿叶斑病毒在组织中的分布第137-138页
   ·RT 组分浓度对原位PCR 效果的影响第138-140页
     ·RNasin 浓度的影响第138页
     ·dNTPs 浓度对扩增效果的影响第138-139页
     ·AMV 浓度对 RT 效果的影响第139-140页
     ·引物浓度对结果的影响第140页
   ·原位扩增中各因素对 PCR 效果的影响第140-144页
     ·退火温度对 PCR 的影响第140-141页
     ·循环次数对原位 PCR 效果的影响第141-142页
     ·引物浓度对原位 PCR 效果的影响第142页
     ·Taq 浓度对 PCR 的影响第142-143页
     ·Mg~(2+)量对原位PCR效果的影响第143-144页
 3 讨论第144-147页
   ·固定剂的选用与固定时间的确定第144页
   ·蛋白酶消化时间的确定第144-145页
   ·地高辛标记核苷酸的使用第145页
   ·原位 PCR 的反应体系各组分对结果的影响第145-146页
   ·原位 PCR 检测梨病毒的敏感性与特异性第146-147页
结论第147-148页
参考文献第148-158页
附录第158-166页
英文摘要第166-169页
攻读博士学位论文期间发表的文章目录第169-171页
致谢第171-172页
论文图表统计第172页

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