| 中文摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-14页 |
| 第一部分 综述 | 第14-57页 |
| 第一篇 基因工程抗体及噬菌体抗体库技术 | 第15-49页 |
| 第一章 基因工程抗体的免疫学础 | 第15-23页 |
| 一、抗体研究的历史 | 第15-18页 |
| (一) 抗体概念的由来 | 第15-16页 |
| (二) 抗体形成理论的提出 | 第16-18页 |
| 二、抗体的分子结构和功能 | 第18-23页 |
| (一) 抗体的分子结构 | 第18-20页 |
| (二) 抗体分子的功能 | 第20-22页 |
| (三) 抗体基因的结构和抗体多样性 | 第22-23页 |
| 第二章 基因工程抗体 | 第23-31页 |
| 一、抗体制备技术 | 第23-25页 |
| 二、基因工程抗体 | 第25-31页 |
| (一) 嵌合抗体 | 第26-27页 |
| (二) 改型抗体 | 第27-29页 |
| (三) 小分子抗体 | 第29-30页 |
| (四) 利用转基因小鼠制备人源抗体 | 第30-31页 |
| 第三章 噬菌体抗体库技术 | 第31-47页 |
| 一、噬菌体呈示原理 | 第33-36页 |
| (一) 丝状噬菌体简介 | 第33页 |
| (二) 丝状噬菌体呈示外源蛋白的途径 | 第33-35页 |
| (三) 丝状噬菌体呈示系统的类型 | 第35-36页 |
| 二、噬菌体抗体库的类别 | 第36-40页 |
| (一) 免疫抗体库 | 第36-37页 |
| (二) 天然抗体库 | 第37-38页 |
| (三) 合成抗体库 | 第38页 |
| (四) 次级抗体库 | 第38-40页 |
| 三、抗体库容量的理论计算及抗体库的多样性 | 第40-44页 |
| 四、噬菌体抗体库的筛选方法及进展 | 第44-47页 |
| (一) 表位筛选 | 第44-46页 |
| (二) 功能性筛选 | 第46-47页 |
| (三) 选择性感染筛选 | 第47页 |
| 展望 | 第47-49页 |
| 第二篇 分子定向进化 | 第49-57页 |
| 第一章 进化学说的历史发展概论 | 第49-50页 |
| 第二章 分子定向进化 | 第50-56页 |
| 一、分子定向进化的概念、产生和发展 | 第50-51页 |
| 二、分子定向进化的原理和实用技术 | 第51-53页 |
| (一) 突变策略 | 第52-53页 |
| (二) 选择和扩增 | 第53页 |
| 三、分子定向进化的应用和研究进展 | 第53-56页 |
| (一) DNA的分子定向进化 | 第53-54页 |
| (二) RNA的分子定向进化 | 第54页 |
| (三) 蛋白质的分子定向进化 | 第54-55页 |
| (四) 抗体的分子定向进化 | 第55-56页 |
| 展望 | 第56-57页 |
| 第二部分 定点诱变实现抗CD3改型单链抗体的分子定向进化 | 第57-110页 |
| 第一章 引言 | 第58-61页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第61-91页 |
| 一、E.coli菌株、质粒载体、辅助噬菌体及细胞株 | 第61-62页 |
| (一) E.coli菌株 | 第61-62页 |
| (二) 质粒载体 | 第62页 |
| (三) 辅助噬菌体 | 第62页 |
| (四) 细胞株 | 第62页 |
| 二、试剂、溶液及设备 | 第62-68页 |
| (一) 试剂 | 第62-64页 |
| (二) 溶液 | 第64-68页 |
| (三) 仪器设备 | 第68页 |
| 三、实验方法 | 第68-91页 |
| (一) 常规实验方法 | 第68-69页 |
| (二) 巨型引物PCR法构建抗CD3改型单链抗体(ReCD3 ScFV)的DNA突变体库 | 第69-75页 |
| (三) 定点诱变次级抗体库(MPCD3)的克隆与转化 | 第75-79页 |
| (四) MPCD3定点诱变次级噬菌体抗体库的构建 | 第79-84页 |
| (五) MPCD3次级噬菌体抗体库的亲和淘选 | 第84-88页 |
| (六) MPCD3抗体库高亲和力抗体的筛选 | 第88-90页 |
| (七) MPCD3高亲和力抗体的诱导表达 | 第90-91页 |
| (八) MPCD3高亲和力抗体的分子结构模拟 | 第91页 |
| 第三章 结果 | 第91-107页 |
| 一、抗CD3改型单链抗体(ReCD3)定点诱变次级抗体库的构建 | 第91-95页 |
| (一) 抗CD3改型单链抗体(ReCD3)和鼠源单抗OKT3分子结构模拟的结果 | 第91-93页 |
| (二) 第一轮PCR(巨型引物)的扩增结果 | 第93页 |
| (三) 巨型引物PCR法(megaprimer PCR)构建ReCD3 DNA突变体库 | 第93-95页 |
| 二、ReCD3定点诱变次级抗体库(MPCD3)的克隆与转化 | 第95-99页 |
| (一) XL1-Blue recA基因型的鉴定和筛选 | 第95-96页 |
| (二) XL1-Blue的生长曲线 | 第96-97页 |
| (三) MPCD3 XL1-Blue次级抗体库的构建 | 第97-99页 |
| 三、MPCD3次级噬菌体抗体库的制备 | 第99-102页 |
| (一) M13KO7的滴度测定 | 第99页 |
| (二) M13KO7辅助呈示能力的检测 | 第99-100页 |
| (三) 感染复数MOI对M13KO7超感染效率的影响 | 第100-101页 |
| (四) M13KO7超感染MPCD3 XL1-Blue的效率 | 第101页 |
| (五) MPCD3次级噬菌体抗体库的滴度 | 第101页 |
| (六) MPCD3次级噬菌体抗体库中M13KO7野生型噬菌体所占比例 | 第101-102页 |
| 四、MPCD3次级噬菌体抗体库的亲和淘选 | 第102-104页 |
| (一) CD3分子膜抗原的含量测定 | 第102页 |
| (二) CD3分子膜抗原活性的检测 | 第102页 |
| (三) MPCD3次级抗体库的亲和淘选 | 第102-103页 |
| (四) MPCD3次Ⅲ级噬菌体抗体库的噬菌体DNA | 第103-104页 |
| 五、ReCD3突点诱变次级抗体库为高亲和力抗体的筛选 | 第104-106页 |
| (一) MPCD3次Ⅲ级抗体库阳性克隆的筛选 | 第104页 |
| (二) 初筛 | 第104-105页 |
| (三) 复筛 | 第105页 |
| (四) 四株高亲和力抗CD3改型单链抗体的序列分析和分子结构模拟 | 第105-106页 |
| 六、ReCD3高亲和力抗体的表达 | 第106-107页 |
| 第四章 讨论 | 第107-110页 |
| 第三部分 DNA改组(DNA shuffling)实现抗CD3改型单链抗体的分子定向进化 | 第110-147页 |
| 第一章 引言 | 第111-114页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第114-129页 |
| 一、E.coli菌株、质粒载体、辅助噬菌体及细胞株 | 第114页 |
| 二、试剂和溶液 | 第114-115页 |
| 三、实验方法 | 第115-129页 |
| (一) 常规实验方法 | 第115页 |
| (二) 抗CD3改型单链抗体(ReCD3)DNA改组 | 第115-118页 |
| (三) ReCD3 DNA改组片段(ShuCD3)的克隆 | 第118-120页 |
| (四) ShuCD3 XL1-Blue次级抗体库的制备 | 第120-121页 |
| (五) ShuCD3次级噬菌体抗体库的制备 | 第121-123页 |
| (六) ShuCD3次级噬菌体抗体库的亲和淘选 | 第123-127页 |
| (七) ShuCD3次级抗体库高亲和力抗体的筛选 | 第127-128页 |
| (八) ShuCD3高亲和力抗体的诱导表达 | 第128-129页 |
| 第三章 结果 | 第129-144页 |
| 一、抗CD3改型单链抗体(ReCD3)的DNA改组 | 第129-132页 |
| (一) DNaseⅠ的最佳酶切条件 | 第129-130页 |
| (二) DNaseⅠ酶切片段的回收 | 第130页 |
| (三) 自身PCR | 第130-131页 |
| (四) ReCD3 DNA改组全长突变体DNA ShuCD3的获得 | 第131页 |
| (五) ReCD3 DNA改组的结果分析 | 第131-132页 |
| 二、ShuCD3 XL1-Blue次级抗体库的制备 | 第132-135页 |
| (一) 去磷酸化对连接效率的影响 | 第132-133页 |
| (二) ShuCD3 XL1-Blue次级抗体库的库容大小 | 第133页 |
| (三) ShuCD3 XL1-Blue次级抗体库的阳性克隆率 | 第133-135页 |
| 三、ShuCD3次级噬菌体抗体库的制备 | 第135-137页 |
| (一) M13KO7的滴度测定 | 第135页 |
| (二) M13KO7超感染ShuCD3 XL1-Blue次级抗体库的效率 | 第135页 |
| (三) ShuCD3次级噬菌体抗体库的滴度 | 第135-136页 |
| (四) ShuCD3次级噬菌体抗体库中M13KO7野生噬菌体滴度 | 第136-137页 |
| 四、ShuCD3次级噬菌体的亲和淘选 | 第137-138页 |
| 五、ShuCD3次Ⅲ级噬菌抗体库的噬菌体DNA | 第138页 |
| 六、ReCD3 DNA改组次级抗体库高亲和力抗体的筛选 | 第138-139页 |
| (一) 初筛 | 第138-139页 |
| (二) 复筛 | 第139页 |
| 七、ShuCD3高亲和力抗体的序列比较和分子结构模拟 | 第139-141页 |
| 八、ShuCD3高亲和力突变株的表达 | 第141-144页 |
| 第四章 讨论 | 第144-145页 |
| 展望 | 第145-147页 |
| 结语 | 第147-148页 |
| 参考文献 | 第148-157页 |
| 附录1 | 第157-158页 |
| 附录2 | 第158-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 作者简历 | 第160-161页 |
