| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 前言 | 第12-37页 |
| 1 海水养殖及其细菌性病害 | 第12-13页 |
| 2 病原弧菌的致病机理 | 第13-32页 |
| ·黏附作用(Adhesion) | 第14-16页 |
| ·铁吸收系统(Iron uptake system) | 第16-21页 |
| ·荚膜(Capsule) | 第21-23页 |
| ·外膜蛋白(Outer membrane protein) | 第23-24页 |
| ·脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) | 第24页 |
| ·磷脂酶(phospholipase) | 第24-26页 |
| ·溶血素(hemolysin) | 第26-32页 |
| 3 哈维氏弧菌 | 第32-35页 |
| ·哈维氏弧菌的致病性 | 第33-34页 |
| ·哈维氏弧菌的致病机制 | 第34-35页 |
| 4 本论文研究的目的和意义 | 第35-37页 |
| 1 材料与方法 | 第37-65页 |
| ·菌株和质粒 | 第37-39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·试剂和仪器 | 第40页 |
| ·VHH溶血素的重组表达、纯化与检测 | 第40-43页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24d(+)/vhhA的表达 | 第40页 |
| ·从菌体中纯化VHH溶血素 | 第40-41页 |
| ·从培养上清液中纯化VHH溶血素 | 第41页 |
| ·Ni琼脂糖亲和柱亲和层析 | 第41页 |
| ·Ni琼脂糖亲和亲和柱的处理与再生 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE检测重组蛋白纯度 | 第42-43页 |
| ·蛋白含量测定 | 第43页 |
| ·VHH溶血素的磷脂酶活性检测 | 第43页 |
| ·VHH溶血素的溶血活性检测 | 第43页 |
| ·气相色谱确定VHH溶血素水解底物的位点 | 第43-44页 |
| ·VHH溶血素的化学修饰 | 第44页 |
| ·VHH溶血素磷脂酶活性的抑制作用研究 | 第44-45页 |
| ·通过定点突变研究哈维氏弧菌VHH溶血素的活性位点 | 第45-55页 |
| ·VHH的磷脂酶活性催化位点的确定 | 第45页 |
| ·VHH磷脂酶结构域的同源建模 | 第45页 |
| ·VHH磷脂酶结构域与磷脂酰胆碱的分子对接 | 第45页 |
| ·突变引物的设计 | 第45-46页 |
| ·模板质粒DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·对vhhA基因的定点突变 | 第47-49页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第49-50页 |
| ·突变重组质粒的转化 | 第50页 |
| ·突变重组质粒的鉴定 | 第50-52页 |
| ·突变的哈维氏弧菌VHH溶血素基因在大肠杆菌的表达 | 第52-53页 |
| ·突变的VHH溶血素S153G的纯化和检测 | 第53-55页 |
| ·Southern blotting | 第55-61页 |
| ·哈维氏弧菌VIB645菌株基因组DNA的提取 | 第55-56页 |
| ·哈维氏弧菌VIB645菌株质粒DNA的提取 | 第56-57页 |
| ·哈维氏弧菌VIB645菌株质粒DNA的纯化 | 第57-58页 |
| ·探针引物设计及合成 | 第58页 |
| ·地高辛(DIG)标记的vhh溶血素基因探针的合成 | 第58-59页 |
| ·Southern blotting分析两个vhh溶血素基因在哈维氏弧菌VIB645菌株染色体和质粒DNA中的分布 | 第59-61页 |
| ·哈维氏弧菌VIB647vhh溶血素基因的克隆、测序与分析 | 第61-65页 |
| ·溶血素基因vhh的引物设计及合成 | 第61页 |
| ·VIB647vhh基因的PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·扩增产物的检测及纯化 | 第62页 |
| ·PCR纯化产物与pUCm-T载体的连接 | 第62页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第62页 |
| ·重组质粒的转化 | 第62-63页 |
| ·质粒提取 | 第63页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第63页 |
| ·VIB647vhh溶血素基因的测序与分析 | 第63-65页 |
| 2 结果与分析 | 第65-92页 |
| ·VHH溶血素磷脂酶活性类型的确定 | 第65页 |
| ·VHH溶血素的化学修饰 | 第65-71页 |
| ·对VHH酸性氨基酸残基的化学修饰 | 第67页 |
| ·对VHH氨基的化学修饰 | 第67-68页 |
| ·对VHH组氨酸咪唑基的化学修饰 | 第68-69页 |
| ·对VHH精氨酸胍基的化学修饰 | 第69页 |
| ·对VHH二硫键的化学修饰 | 第69-70页 |
| ·对VHH的丝氨酸、苏氨酸羟基的化学修饰 | 第70页 |
| ·对VHH半胱氨酸巯基的化学修饰 | 第70-71页 |
| ·对VHH溶血素磷脂酶活性的抑制作用研究 | 第71-74页 |
| ·对VHH溶血素活性位点的研究 | 第74-81页 |
| ·VHH溶血素磷脂酶催化位点的确定 | 第74-75页 |
| ·PCR定点突变vhhA基因——丝氨酸153的突变 | 第75-77页 |
| ·突变的溶血素基因vhhA/S153G在大肠杆菌中的重组表达 | 第77-78页 |
| ·突变溶血素S153G的亲和纯化与检测 | 第78-79页 |
| ·突变溶血素S153G磷脂酶活性和溶血素活性的检测 | 第79-80页 |
| ·S153G对大菱鲆的致病性 | 第80-81页 |
| ·对VHH溶血素与宿主细胞膜作用位点的研究 | 第81-90页 |
| ·VHH溶血素磷脂酶结构域的同源建模 | 第81-82页 |
| ·VHH溶血素磷脂酶结构域与磷脂酰胆碱的分子对接 | 第82-84页 |
| ·对VHH与磷脂酰胆碱结合位点氨基酸残基的定点突变 | 第84-85页 |
| ·对突变溶血素W174A,K270A,Y332A磷脂酶活性的检测 | 第85-86页 |
| ·VHH溶血素N端结构域的de novo建模 | 第86-88页 |
| ·对VHH N端结构域三个氨基酸残基的定点突变 | 第88-89页 |
| ·对突变溶血素C49A,W81A,C104A磷脂酶活性的检测 | 第89-90页 |
| ·Southern blotting检测VIB645菌株中两个溶血素基因的分布 | 第90页 |
| ·对哈维氏弧菌VIB647菌株溶血素基因的测序和分析 | 第90-92页 |
| 3 讨论 | 第92-102页 |
| 4 小结 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-119页 |
| 附录 | 第119-127页 |
| 致谢 | 第127页 |
