| 目录 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-26页 |
| 1. microRNA的上游转录调控是其整个调控网络的重要组成部分 | 第12页 |
| 2. miR-122是一个肝脏特异性高表达的小RNA | 第12-18页 |
| ·miR-122来源于hcr基因转录本并在物种间具有高度进化保守性 | 第13-15页 |
| ·miR-122参与肝脏的分化发育和代谢的精细调控过程 | 第15-18页 |
| 3. Fox01是参与代谢调节的重要转录因子 | 第18-25页 |
| ·FoxO转录因子蛋白家族的组成和结构特点 | 第18-20页 |
| ·FoxO蛋白主要是作为核内的转录因子行使对靶基因的调控功能 | 第20-23页 |
| ·FoxO蛋白的核定位受P13K/Akt等通路调控 | 第23-24页 |
| ·Fox01在维系机体代谢平衡的稳态中起关键作用 | 第24-25页 |
| 4. 本课题研究的理论问题与实验设计 | 第25-26页 |
| 材料与方法 | 第26-46页 |
| 1. 实验材料 | 第26-29页 |
| ·菌株与质粒 | 第26页 |
| ·细胞系 | 第26页 |
| ·转染试剂 | 第26页 |
| ·蛋白酶抑制剂 | 第26-27页 |
| ·限制性内切酶及其他修饰酶 | 第27页 |
| ·抗体 | 第27页 |
| ·其它主要试剂 | 第27页 |
| ·引物合成 | 第27-28页 |
| ·主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2. 实验方法 | 第29页 |
| ·本实验的实验流程图 | 第29页 |
| ·生物信息学分析 | 第29页 |
| ·细菌操作与质粒的转化提取 | 第29-31页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5α制备 | 第29-30页 |
| ·质粒的转化 | 第30页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第30-31页 |
| ·细胞培养 | 第31-32页 |
| ·细胞生长条件 | 第31页 |
| ·细胞传代 | 第31-32页 |
| ·细胞的复苏和冻存 | 第32页 |
| ·非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染 | 第32页 |
| ·逆转录病毒的包装与转导 | 第32-34页 |
| ·载体构建 | 第32-33页 |
| ·阳离子转染试剂转染293T细胞 | 第33-34页 |
| ·逆转录病毒上清收集及冻存 | 第34页 |
| ·逆转录病毒转导靶细胞 | 第34页 |
| ·逆转录病毒感染后细胞的筛选和混合克隆的获得 | 第34-35页 |
| ·筛选药物的配制 | 第34页 |
| ·混合克隆细胞株的获得 | 第34-35页 |
| ·半定量和定量RT-PCR | 第35-36页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第35页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第35页 |
| ·RT-PCR检测 | 第35-36页 |
| ·Real-time PCR检测 | 第36页 |
| ·Western Blot分析 | 第36-40页 |
| ·裂解细胞 | 第36页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第36-37页 |
| ·BCA法测定蛋白质浓度的实验原理 | 第36-37页 |
| ·实验步骤 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE | 第37页 |
| ·转膜 | 第37-38页 |
| ·抗原抗体反应 | 第38页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法 | 第38-39页 |
| ·Western Blot所用的各种溶液 | 第39-40页 |
| ·双荧光素酶报告基因系统检测 | 第40页 |
| ·细胞的转染 | 第40页 |
| ·荧光测定 | 第40页 |
| ·EMSA | 第40-43页 |
| ·核蛋白提取 | 第40-41页 |
| ·生物素标记探针 | 第41页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第41-42页 |
| ·杂交及显影 | 第42页 |
| ·溶液配制 | 第42-43页 |
| ·染色质免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP) | 第43-46页 |
| ·固定细胞 | 第43页 |
| ·全细胞抽提物(whole-cell extract,WCE)的获得 | 第43-44页 |
| ·免疫沉淀 | 第44页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第44页 |
| ·PCR定量分析 | 第44-45页 |
| ·ChIP实验中所用的各种溶液 | 第45-46页 |
| 实验结果 | 第46-67页 |
| 1. 通过生物信息学分析预测FOXO1在miR-122核心启动子区存在一个保守的结合位点 | 第46-51页 |
| ·UCSC Genome Bioinformatics分析 | 第46-47页 |
| ·ECR Browser保守性分析 | 第47-48页 |
| ·rVista 2.0预测转录因子结合位点(TFBS) | 第48-51页 |
| 2. FOXO1野生型蛋白和突变型蛋白对miR-122的转录调控作用是相反的 | 第51-56页 |
| ·瞬时转染FOXO1-WT上调miR-122的转录而FOXO1-CA下调其转录 | 第51-54页 |
| ·FOXO1系列表达质粒在Huh7细胞中的有效性鉴定 | 第51-52页 |
| ·瞬时转染FOXO1质粒后对miR-122转录的影响 | 第52-53页 |
| ·不同浓度的insulin对瞬时转染FOXO1质粒后miR-122转录的影响 | 第53-54页 |
| ·稳定转染FOXO1对miR-122转录的影响与瞬时转染效果一致 | 第54-56页 |
| 3. FOX01通过miR-122核心启动子区的IRE元件调控miR-122的转录 | 第56-59页 |
| ·通过截短实验来聚焦FOXO1在miR-122上游的相应顺式调控区域 | 第56-58页 |
| ·通过突变实验来精确定位FOXO1在miR-122核心启动子区内的作用位点 | 第58-59页 |
| 4. FOXO1可结合于miR-122核心启动子区IRE元件 | 第59-67页 |
| ·FOXO1在体外实验中直接结合于miR-122核心启动子区IRE元件 | 第60-62页 |
| ·营养状态改变的情况下FOXO1动态结合于miR-122上游的核心启动子区 | 第62-64页 |
| ·FOXO1和HNF4在miR-122核心promoter区上相同区域的结合呈互逆状态 | 第64-67页 |
| 讨论 | 第67-79页 |
| 1. FOXO1的核定位调节对miR-122转录调控作用的影响 | 第67-70页 |
| 2. FOXO1和HNF4调控miR-122转录的模式 | 第70-76页 |
| ·FOXO1与HNF4的不同组合模式在调控其它代谢相关基因中的表现 | 第71-73页 |
| ·FOXO蛋白与许多核激素受体家族成员间的相互作用影响两者转录活性 | 第73-74页 |
| ·FOXO1与HNF4在miR-122核心启动子区竞争结合 | 第74-76页 |
| 3. FOXO1对miR-122转录的调控受营养状态的调节 | 第76-77页 |
| 4. 本研究的不足及展望 | 第77-79页 |
| 小结 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 非论文综述 | 第87-106页 |
| Reference | 第99-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 个人简历 | 第107-109页 |
