| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第13-50页 |
| 1.1 古菌概述 | 第13-16页 |
| 1.2 硫化叶菌 | 第16-17页 |
| 1.3 硫化叶菌的遗传操作体系 | 第17-32页 |
| 1.3.1 筛选标记 | 第17-19页 |
| 1.3.2 受体菌株 | 第19-21页 |
| 1.3.3 转化方法 | 第21-22页 |
| 1.3.4 硫化叶菌-大肠杆菌穿梭载体 | 第22-26页 |
| 1.3.5 硫化叶菌中的敲除体系 | 第26-32页 |
| 1.4 增殖细胞核抗原(PCNA)简介 | 第32-40页 |
| 1.4.1 PCNA的发现 | 第32页 |
| 1.4.2 PCNA的结构 | 第32-34页 |
| 1.4.3 PCNA的功能及与PCNA相互作用的蛋白 | 第34-36页 |
| 1.4.4 古菌中PCNA研究进展 | 第36-40页 |
| 1.5 古菌的核苷酸切除修复 | 第40-47页 |
| 1.5.1 核苷酸切除修复的基本过程 | 第40页 |
| 1.5.2 古菌核苷酸切除修复研究概况 | 第40-47页 |
| 1.6 古菌中的光修复 | 第47-48页 |
| 1.7 研究的目的与意义 | 第48-50页 |
| 2 材料与方法 | 第50-67页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第50-51页 |
| 2.2 培养基配方及培养条件 | 第51-54页 |
| 2.3 常用生化试剂及缓冲液配方 | 第54-56页 |
| 2.4 主要的分子生物学试剂 | 第56页 |
| 2.5 实验方法 | 第56-67页 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第56-57页 |
| 2.5.2 基因敲除载体的构建 | 第57-58页 |
| 2.5.3 硫化叶菌菌种保存方法 | 第58页 |
| 2.5.4 硫化叶菌感受态细胞的制备及转化 | 第58-59页 |
| 2.5.5 硫化叶菌总DNA和质粒DNA的提取 | 第59-60页 |
| 2.5.6 硫化叶菌RNA的提取及定量 | 第60-61页 |
| 2.5.7 反转录-荧光定量PCR实验 | 第61页 |
| 2.5.8 重组蛋白在大肠杆菌中的过量表达及其纯化 | 第61-63页 |
| 2.5.9 多克隆抗体的制备与纯化 | 第63页 |
| 2.5.10 酶联免疫法检测抗体效价 | 第63-64页 |
| 2.5.11 BCA法测定重组蛋白的浓度 | 第64页 |
| 2.5.12 SDS-PAGE和Western-blot实验 | 第64-65页 |
| 2.5.13 Southern blot | 第65-66页 |
| 2.5.14 流式细胞分析(Flow cytometry analysis) | 第66-67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-117页 |
| 3.1 泉古菌中PCNA的同源性分析 | 第67-68页 |
| 3.2 冰岛硫化叶菌中pcna的遗传分析 | 第68-96页 |
| 3.2.1 用两种传统的基因敲除方法敲除pcna | 第68-74页 |
| 3.2.1.1 AR,MRL敲除策略及pcna敲除载体的构建 | 第68-72页 |
| 3.2.1.2 pAR-pcna,pMRL-pcna转化冰岛硫化叶菌E233S及转化子验证 | 第72-74页 |
| 3.2.2 用新的基因敲除方法敲除pcna,xpf | 第74-95页 |
| 3.2.2.1 MID敲除策略及pMID-pcna,xpf载体的构建 | 第74-77页 |
| 3.2.2.2 pMID-pcna,-xpf载体转化冰岛硫化叶菌E233S及转化子验证 | 第77-79页 |
| 3.2.2.3 pcna,xpf缺失突变株的筛选及验证 | 第79-85页 |
| 3.2.2.4 pMID-araS-pcnal,2,3转化冰岛硫化叶菌E233S及突变株的筛选 | 第85-87页 |
| 3.2.2.5 pMID转化子在5-FOA平板上菌落的形成效率 | 第87-88页 |
| 3.2.2.6 pMID-pcna,xpf转化子的反筛选富集实验 | 第88-93页 |
| 3.2.2.7 半定量PCR分析突变株富集情况 | 第93-95页 |
| 3.2.3 应用MID敲除方法敲除冰岛硫化叶菌NER和光修复有关基因 | 第95-96页 |
| 3.3 冰岛硫化叶菌pcna基因在转录水平的差异 | 第96-100页 |
| 3.4 冰岛硫化叶菌pcna基因在蛋白水平的差异 | 第100-109页 |
| 3.4.1 PCNA原核表达载体的构建 | 第100-102页 |
| 3.4.2 PCNA在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第102-105页 |
| 3.4.3 多克隆抗体的制备、纯化及效价检测 | 第105-106页 |
| 3.4.4 Western-blot检测冰岛硫化叶菌三个PCNA蛋白的表达差异 | 第106-109页 |
| 3.5 PCNA在冰岛硫化叶菌体内的过量表达与分析 | 第109-117页 |
| 3.5.1 表达载体的构建及硫化叶菌转化子的检测 | 第109-112页 |
| 3.5.2 Western-blot检测PCNA在体内的过量表达 | 第112-113页 |
| 3.5.3 PCNA过量表达对细胞生长的影响 | 第113-117页 |
| 4 讨论与展望 | 第117-125页 |
| 4.1 冰岛硫化叶菌遗传操作体系的完善 | 第117-118页 |
| 4.2 冰岛硫化叶菌中一种新的基因敲除策略的建立 | 第118-119页 |
| 4.3 基于突变体富集的基因敲除策略应用于冰岛硫化叶菌pcna必需性的鉴定 | 第119-122页 |
| 4.4 冰岛硫化叶菌PCNA的表达调控 | 第122-123页 |
| 4.5 新的敲除体系用于冰岛硫化叶菌NER修复和光修复有关基因的遗传学研究 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-141页 |
| 附录 | 第141-144页 |
| 博士期间学术成果 | 第144-145页 |
| 致谢 | 第145页 |
