| 致谢 | 第4-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| 第一部分 钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶活性及致病性研究 | 第5-7页 |
| 第二部分 不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势抗原表位筛选与鉴定 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| Part-Ⅰ Activity and pathogenicity of M23 superfamily metalloendopeptidases ofLeptospira interrogans | 第8-11页 |
| Part-Ⅱ Screening and identification of predominant antigenic epitopes in OMP6 ofnontypeable Haemophilus influenzae | 第11-13页 |
| 英文缩写词表 | 第13-20页 |
| 第一部分 钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶活性及致病性研究 | 第20-67页 |
| 第1章 引言 | 第20-24页 |
| 1.1 钩端螺旋体 | 第20页 |
| 1.2 钩端螺旋体病 | 第20-21页 |
| 1.3 细菌胞外金属蛋白酶 | 第21-22页 |
| 1.4 研究内容及目的 | 第22-23页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第22-23页 |
| 1.4.2 研究目的 | 第23页 |
| 1.5 研究路线 | 第23-24页 |
| 第2章 原核表达系统的构建及表达产物抗体的制备 | 第24-45页 |
| 2.1 材料 | 第24-28页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第24页 |
| 2.1.2 实验质粒 | 第24页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第24页 |
| 2.1.4 主要仪器及器材 | 第24-25页 |
| 2.1.5 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.6 主要试剂配制 | 第26-28页 |
| 2.2 方法 | 第28-39页 |
| 2.2.1 问号钩体LA2582和LA2901基因序列生物信息学分析 | 第28页 |
| 2.2.2 问号钩体的培养 | 第28页 |
| 2.2.3 问号钩体基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.4 目的基因的扩增和纯化 | 第29-31页 |
| 2.2.4.1 引物设计 | 第29-30页 |
| 2.2.4.2 目的基因的扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.4.3 PCR扩增片段的纯化 | 第31页 |
| 2.2.5 T-A克隆 | 第31-34页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌DH5a和BL21DE3感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.5.2 连接 | 第32页 |
| 2.2.5.3 转化 | 第32页 |
| 2.2.5.4 目的重组质粒的提取 | 第32-33页 |
| 2.2.5.5 质粒pMD19-T~(LA2582)和pMD19-T~(LA2901)的双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.6 LA2582和LA2901基因原核表达系统的构建及其重组蛋白的纯化 | 第34-39页 |
| 2.2.6.1 目的基因片段的回收 | 第34页 |
| 2.2.6.2 连接 | 第34-35页 |
| 2.2.6.3 转化 | 第35页 |
| 2.2.6.4 重组表达质粒的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.6.5 质粒pET-42a~(LA2582)和pET-42a~(LA2901)的双酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.2.6.6 重组蛋白的诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.2.6.7 SDS-PAGE电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.6.8 重组蛋白rLA2582和rLA2901的提取与纯化 | 第38页 |
| 2.2.6.9 rLA2582-IgG和rLA2901-IgG制备 | 第38-39页 |
| 2.2.6.10 免疫双向扩散法检测rLA2582-IgG和rLA2901-IgG效价 | 第39页 |
| 2.3 结果 | 第39-44页 |
| 2.3.1 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列跨膜预测结果 | 第39-40页 |
| 2.3.2 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列信号肽预测结果 | 第40-41页 |
| 2.3.3 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列功能结构域预测结果 | 第41-42页 |
| 2.3.4 PCR结果 | 第42页 |
| 2.3.5 T-A克隆鉴定结果 | 第42-43页 |
| 2.3.6 亚克隆鉴定结果 | 第43页 |
| 2.3.7 LA2582和LA2901表达纯化结果及其抗血清效价 | 第43-44页 |
| 2.4 小结 | 第44-45页 |
| 第3章 钩端螺旋体M23金属内肽酶酶学活性研究 | 第45-52页 |
| 3.1 材料 | 第45-46页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第45-46页 |
| 3.2 方法 | 第46-48页 |
| 3.2.1 偶氮酪蛋白水解试验 | 第46-47页 |
| 3.2.2 荧光五肽底物水解试验 | 第47页 |
| 3.2.3 Km和Kcat值测定 | 第47-48页 |
| 3.2.4 COL1和FN水解试验 | 第48页 |
| 3.2.5 ELN水解试验 | 第48页 |
| 3.3 结果 | 第48-51页 |
| 3.3.1 水解活性及Km值和Kcat值 | 第48-50页 |
| 3.3.2 水解COL1和FN活性 | 第50页 |
| 3.3.3 ELN水解结果 | 第50-51页 |
| 3.4 小结 | 第51-52页 |
| 第4章 钩体感染细胞时基因mRNA、蛋白表达及外分泌检测 | 第52-61页 |
| 4.1 材料 | 第52-54页 |
| 4.1.1 实验菌株 | 第52页 |
| 4.1.2 实验材料 | 第52页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第52页 |
| 4.1.4 主要试剂 | 第52-53页 |
| 4.1.5 主要试剂配制 | 第53-54页 |
| 4.2 方法 | 第54-58页 |
| 4.2.1 HUVEC的培养 | 第54-55页 |
| 4.2.2 RT-PCT引物 | 第55页 |
| 4.2.3 建立钩体感染HUVEC模型 | 第55页 |
| 4.2.4 问号钩体总RNA的提取 | 第55-56页 |
| 4.2.5 反转录反应 | 第56页 |
| 4.2.6 qRT-PCR | 第56-57页 |
| 4.2.7 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物表达水平变化 | 第57页 |
| 4.2.8 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物外分泌检测 | 第57-58页 |
| 4.3 结果 | 第58-60页 |
| 4.3.1 qRT-PCR结果 | 第58页 |
| 4.3.2 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物表达水平升高 | 第58-59页 |
| 4.3.3 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物外分泌水平增加 | 第59-60页 |
| 4.4 小结 | 第60-61页 |
| 第5章 结果与讨论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 第二部分 不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势抗原表位筛选与鉴定 | 第67-84页 |
| 第1章 引言 | 第67-68页 |
| 1.1 研究背景 | 第67页 |
| 1.2 研究内容 | 第67页 |
| 1.3 研究目的 | 第67-68页 |
| 第2章 TA克隆及基因序列与膜定位分析 | 第68-72页 |
| 2.1 材料 | 第68页 |
| 2.1.1 菌株来源及其培养 | 第68页 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 | 第68页 |
| 2.2 方法 | 第68-70页 |
| 2.2.1 NTHi临床菌株及ATCC49247株基因组DNA的提取 | 第68页 |
| 2.2.2 omp6基因扩增及其产物测序 | 第68-69页 |
| 2.2.3 omp6基因序列和膜定位分析 | 第69-70页 |
| 2.3 结果 | 第70-71页 |
| 2.3.1 omp6基因检测和分析结果 | 第70页 |
| 2.3.2 OMP6膜定位分析结果 | 第70-71页 |
| 2.4 小结 | 第71-72页 |
| 第3章 T-B联合抗原表位预测及其序列的扩增、克隆与鉴定 | 第72-75页 |
| 3.1 实验材料 | 第72页 |
| 3.1.1 主要实验试剂 | 第72页 |
| 3.2 方法 | 第72-73页 |
| 3.2.1 T-B联合抗原表位预测 | 第72页 |
| 3.2.2 T-B联合抗原表位肽序列扩增、克隆和鉴定 | 第72-73页 |
| 3.3 结果 | 第73-74页 |
| 3.3.1 T-B联合抗原表位预测结果 | 第73页 |
| 3.3.2 T-B联合表位肽编码序列扩增和测序结果 | 第73-74页 |
| 3.4 小结 | 第74-75页 |
| 第4章 OMP6 M13KE展示肽系统的构建及其免疫反应性与抗原性检测 | 第75-79页 |
| 4.1 材料 | 第75页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第75页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第75页 |
| 4.2 方法 | 第75-77页 |
| 4.2.1 M13KE展示肽系统构建及鉴定 | 第75-76页 |
| 4.2.2 重组噬菌体扩增和提取 | 第76页 |
| 4.2.3 免疫反应性检测 | 第76页 |
| 4.2.4 抗原性检测 | 第76-77页 |
| 4.3 结果 | 第77-78页 |
| 4.3.1 免疫印迹法检测结果 | 第77页 |
| 4.3.2 ELISA检测结果 | 第77-78页 |
| 4.4 小结 | 第78-79页 |
| 第5章 结论 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-84页 |
| 综述 | 第84-96页 |
| 参考文献 | 第90-96页 |
| 作者简历与攻读学位期间取得的科研成果 | 第96页 |
