| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第1章 前言 | 第13-23页 |
| 1.1 概述 | 第13-14页 |
| 1.2 蛙科动物抗菌肽分类 | 第14-19页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.4 本文目的与意义 | 第22-23页 |
| 第2章 东北林蛙皮肤抗菌肽基因的克隆和序列分析 | 第23-40页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第23页 |
| 2.2.2 菌种和载体 | 第23页 |
| 2.2.3 工具酶与生化试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 | 第24页 |
| 2.2.5 溶液与培养基的配制 | 第24-26页 |
| 2.3 方法 | 第26-32页 |
| 2.3.1 东北林蛙抗菌肽通用引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.3.2 东北林蛙皮肤总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.3.3 东北林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆 | 第27-32页 |
| 2.4 结果 | 第32-38页 |
| 2.4.1 引物设计结果 | 第32页 |
| 2.4.2 东北林蛙皮总RNA的提取结果 | 第32-33页 |
| 2.4.3 东北林蛙皮抗菌肽的cDNA扩增结果 | 第33页 |
| 2.4.4 重组质粒的PCR检测验证 | 第33-34页 |
| 2.4.5 测序结果及其序列分析 | 第34-38页 |
| 2.4.6 东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的同源性分析结果 | 第38页 |
| 2.4.7 东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的结构分析 | 第38页 |
| 2.5 讨论 | 第38-40页 |
| 第3章 hEGF-抗菌肽融合多肽真核表达载体的构建 | 第40-51页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1 菌种和载体 | 第40页 |
| 3.2.2 工具酶与生化试剂 | 第40-41页 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 | 第41页 |
| 3.2.4 溶液与培养基的配制 | 第41页 |
| 3.3 方法 | 第41-47页 |
| 3.3.1 实验思路 | 第41-42页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第42-43页 |
| 3.3.3 PCR方法扩增hEGF基因 | 第43-44页 |
| 3.3.4 PCR方法扩增Dybowskin-2CDYa成熟肽序列 | 第44-45页 |
| 3.3.5 PCR方法扩增融合多肽序列 | 第45页 |
| 3.3.6 融合多肽表达质粒的构建及序列分析 | 第45-47页 |
| 3.4 结果 | 第47-49页 |
| 3.4.1 融合多肽 hX2 基因序列的获得 | 第47-48页 |
| 3.4.2 阳性重组质粒的PCR筛选结果 | 第48-49页 |
| 3.4.3 阳性重组子测序结果 | 第49页 |
| 3.5 讨论 | 第49-51页 |
| 第4章 重组基因hX2 毕赤酵母中的表达及检测 | 第51-71页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 材料 | 第51-54页 |
| 4.2.1 实验菌种 | 第51页 |
| 4.2.2 工具酶与生化试剂 | 第51-52页 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 | 第52页 |
| 4.2.4 溶液与培养基的配制 | 第52-54页 |
| 4.3 方法 | 第54-60页 |
| 4.3.1 转化酵母菌的线性质粒制备 | 第54页 |
| 4.3.2 酵母感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| 4.3.3 线性化质粒转化毕赤酵母GS115 | 第55页 |
| 4.3.4 高拷贝转化子的筛选 | 第55-56页 |
| 4.3.5 高拷贝转化子的表型鉴定 | 第56页 |
| 4.3.6 酵母转化子的鉴定 | 第56-57页 |
| 4.3.7 高拷贝阳性转化子的摇瓶诱导表达 | 第57页 |
| 4.3.8 目的基因表达的检测 | 第57-59页 |
| 4.3.9 发酵液中蛋白含量测定 | 第59页 |
| 4.3.10 重组表达蛋白的抑菌活性检测 | 第59-60页 |
| 4.4 结果 | 第60-68页 |
| 4.4.1 高拷贝转化子的表型鉴定 | 第60-61页 |
| 4.4.2 酵母DNA 的提取结果 | 第61页 |
| 4.4.3 酵母转化子的PCR 鉴定结果 | 第61-62页 |
| 4.4.4 阳性转化子 RNA 提取 | 第62-63页 |
| 4.4.5 对酵母mRNA 反转录PCR 结果 | 第63页 |
| 4.4.6 融合多肽Tricine-SDS-PAGE 分析结果 | 第63-64页 |
| 4.4.7 发酵上清液液相色谱检测结果 | 第64-66页 |
| 4.4.8 发酵上清液中蛋白含量的测定 | 第66页 |
| 4.4.9 表达产物抑菌活性检测 | 第66-68页 |
| 4.5 讨论 | 第68-71页 |
| 4.5.1 培养水平对表达的影响 | 第68-69页 |
| 4.5.2 融合多肽的抗菌活性 | 第69-71页 |
| 第5章 结论 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 | 第79-80页 |
