| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语索引 | 第18-20页 |
| 实验仪器及设备 | 第20-22页 |
| 实验试剂 | 第22-25页 |
| 第一章 前言 | 第25-43页 |
| 1.1 Raf激酶激酶与信号通路 | 第25-29页 |
| 1.1.1 Raf激酶家族成员 | 第25-27页 |
| 1.1.2 Raf激酶突变与肿瘤 | 第27-29页 |
| 1.2 肺癌及其治疗 | 第29-31页 |
| 1.2.1 肺癌的病因和危险因素 | 第29-30页 |
| 1.2.2 肺癌的病理类型和分期 | 第30页 |
| 1.2.3 肺癌的治疗手段 | 第30-31页 |
| 1.3 热休克蛋白70 (HSP70) | 第31-34页 |
| 1.3.1 热休克蛋白的发现 | 第31-32页 |
| 1.3.3 HSP70的功能及其作用机制 | 第32-34页 |
| 1.3.4 HSP70与肿瘤的关系 | 第34页 |
| 1.4 GRP78蛋白 | 第34-37页 |
| 1.4.1 GRP78的基因特点 | 第34-35页 |
| 1.4.2 GRP78基因的转录调控 | 第35页 |
| 1.4.3 GRP78的生物学功能 | 第35-36页 |
| 1.4.4 GRP78与肿瘤的关系 | 第36-37页 |
| 1.5 PARP1蛋白 | 第37-41页 |
| 1.5.1 PARP1的发现 | 第37-38页 |
| 1.5.2 PARP1的基因结构特点 | 第38页 |
| 1.5.3 PARP1的功能及作用机制 | 第38-40页 |
| 1.5.4 PARP1与肿瘤的关系 | 第40-41页 |
| 1.6 本论文研究的意义 | 第41-42页 |
| 1.7 实验技术路线 | 第42-43页 |
| 第二章 突变产生pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf (S214C)质粒 | 第43-53页 |
| 2.1 实验内容 | 第43-49页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第44页 |
| 2.1.2 TOYOBO突变试剂盒突变法得到VSV-A-Raf-S214C | 第44-45页 |
| 2.1.3 用Dpn I对模板质粒DNA进行消化 | 第45页 |
| 2.1.4 转化 | 第45-46页 |
| 2.1.5 菌落PCR验证 | 第46-47页 |
| 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳验证菌落PCR反应 | 第47-48页 |
| 2.1.7 抽提质粒,并用酶切法验证突变体 | 第48-49页 |
| 2.1.8 测序并进行序列比对 | 第49页 |
| 2.2 实验结果 | 第49-52页 |
| 2.2.1 菌落PCR验证 | 第49页 |
| 2.2.2 酶切验证 | 第49-50页 |
| 2.2.3 测序比对结果 | 第50-52页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第52-53页 |
| 第三章 A-Raf及其突变体稳定细胞系的构建及验证 | 第53-61页 |
| 3.1 实验内容 | 第53-58页 |
| 3.1.1 细胞转染 | 第53-55页 |
| 3.1.2 对稳定细胞系进行Doxycycline(DOX)浓度梯度诱导 | 第55页 |
| 3.1.3 对稳定细胞系进行Doxycycline(DOX)时间梯度诱导 | 第55-56页 |
| 3.1.4 Western blotting检测 | 第56-58页 |
| 3.2 实验结果 | 第58-59页 |
| 3.2.1 Western blot检测获得最佳诱导浓度 | 第58页 |
| 3.2.2 Western blot检测获得最佳诱导时间 | 第58-59页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第59-61页 |
| 第四章 研究A-Raf-S214C突变体对MAPK信号通路的影响 | 第61-63页 |
| 4.1 实验内容 | 第61-62页 |
| 4.1.1 细胞处理 | 第61页 |
| 4.1.2 细胞收样 | 第61页 |
| 4.1.3 Western blot检测ERK的磷酸化水平 | 第61页 |
| 4.1.4 统计学分析 | 第61-62页 |
| 4.2 实验结果 | 第62页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第62-63页 |
| 第五章 用免疫沉淀法(co-IP)和蛋白组学的方法系统识别A-Raf激酶的结合蛋白 | 第63-71页 |
| 5.1 实验内容 | 第63-65页 |
| 5.1.1 CO-IP实验 | 第63-64页 |
| 5.1.2 Western blot检测 | 第64页 |
| 5.1.3 分析A-Raf结合蛋白 | 第64页 |
| 5.1.4 Co-IP验证A-Raf结合蛋白GRP78和PARP1 | 第64-65页 |
| 5.2 实验结果 | 第65-69页 |
| 5.2.1 Western blot检测A-Raf以及S214C的IP效果 | 第65-66页 |
| 5.2.2 质谱结果 | 第66-67页 |
| 5.2.4 Western blot检测GRP78和PARP1 | 第67-69页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第69-71页 |
| 第六章 基因沉默(Psuper RNAi质粒的构建) | 第71-85页 |
| 6.1 实验内容 | 第71-77页 |
| 6.1.1 设计含有双酶切位点的GRP78和PARP1的shRNA | 第71页 |
| 6.1.2 处理shRNA片段 | 第71页 |
| 6.1.3 酶切Psuper puro载体 | 第71-72页 |
| 6.1.4 酶切后进行琼脂糖凝胶验证并胶回收 | 第72-73页 |
| 6.1.5 连接反应 | 第73-74页 |
| 6.1.6 转化 | 第74页 |
| 6.1.7 酶切验证沉默载体 | 第74页 |
| 6.1.8 序列比对 | 第74页 |
| 6.1.9 构建Psuper RNAi- GRP78和Psuper RNAi- PARP1稳定细胞系 | 第74-75页 |
| 6.1.10 Western blot验证Psuper RNAi- GRP78和Psuper RNAi-PARP1稳定细胞系 | 第75页 |
| 6.1.11 化疗药物敏感实验 | 第75页 |
| 6.1.12 细胞划痕实验 | 第75-76页 |
| 6.1.13 Transwell细胞迁移实验 | 第76-77页 |
| 6.2 实验结果 | 第77-84页 |
| 6.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证BgI Ⅱ和Xoh Ⅰ酶切Psuper puro载体 | 第77页 |
| 6.2.2 酶切验证 | 第77-78页 |
| 6.2.3 测序比对结果 | 第78-80页 |
| 6.2.4 Western blot验证Psuper RNAi- GRP78和Psuper RNAi- PARP1稳定细胞系 | 第80页 |
| 6.2.5 化疗药物敏感实验检测敲减后细胞活性的变化 | 第80-81页 |
| 6.2.6 细胞划痕实验检测PARP1敲减后,细胞迁移能力的改变 | 第81-83页 |
| 6.2.7 Transwell细胞实验检测PARP1敲减后,细胞迁移能力的改变 | 第83-84页 |
| 6.3 小结与讨论 | 第84-85页 |
| 第七章 基因敲除(PX459-gRNA质粒的构建) | 第85-91页 |
| 7.1 实验内容 | 第85-88页 |
| 7.1.1 设计含有双酶切位点的GRP78和PARP1的gRNA | 第85页 |
| 7.1.2 处理shRNA片段 | 第85-86页 |
| 7.1.3 连接 | 第86-88页 |
| 7.1.4 处理连接产物 | 第88页 |
| 7.1.5 转化 | 第88页 |
| 7.1.6 敲除载体的确认 | 第88页 |
| 7.2 实验结果 | 第88-89页 |
| 7.3 小结与讨论 | 第89-91页 |
| 第八章 基因高表达(PCDNA3.1-GRP78/PARP1质粒的构建) | 第91-107页 |
| 8.1 实验内容 | 第91-97页 |
| 8.1.1 引物设计 | 第91页 |
| 8.1.2 处理GRP78和PARP1的高表达引物片段 | 第91-93页 |
| 8.1.3 琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物,并进行胶回收 | 第93页 |
| 8.1.4 限制性酶切GRP78/PARP1引物片段和PCDNA3.1载体 | 第93-95页 |
| 8.1.5 琼脂糖凝胶电泳进行酶切验证,并进行胶回收。 | 第95页 |
| 8.1.6 连接反应 | 第95-96页 |
| 8.1.7 转化(E.coli DH 5 α感受态细胞) | 第96页 |
| 8.1.8 菌落PCR验证 | 第96-97页 |
| 8.1.9 抽提质粒并送测序 | 第97页 |
| 8.1.10 PCDNA3.1-GRP78和PCDNA3.1-PARP1稳定细胞系的构建 | 第97页 |
| 8.1.11 Western blot验证PCDNA3.1-GRP78和PCDNA3.1-PARP1稳定细胞系 | 第97页 |
| 8.2 实验结果 | 第97-105页 |
| 8.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证PCR效果 | 第97-98页 |
| 8.2.2 琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物 | 第98-99页 |
| 8.2.3 琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物 | 第99-100页 |
| 8.2.4 菌落PCR验证 | 第100页 |
| 8.2.5 测序结果比对 | 第100-104页 |
| 8.2.6 Western blot验证PCDNA3.1-GRP78和PCDNA3.1-PARP1稳定细胞系 | 第104-105页 |
| 8.3 小结与讨论 | 第105-107页 |
| 第九章 总结 | 第107-109页 |
| 致谢 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-117页 |
| 附录A A-Raf序列 | 第117-119页 |
| 附录B 攻读硕士期间发表论文目录 | 第119页 |
