牛奶子内参基因的筛选及EutIPI、EutPsy基因功能初步分析

【摘要】：番茄红素(lycopene)是类胡萝卜素的一种,因最早发现于番茄中且呈红色而得名。它是迄今为止自然界中被发现的最强抗氧化剂之一,在防癌抗癌和防治某些慢性疾病、保护皮肤和心血管等方面具有重要作用。牛奶子(Elaeagnus umbellate Thunb.)是一种胡颓子科胡颓子属植物,其成熟果实中富含番茄红素,含量相当于普通番茄的5-18倍,因此研究牛奶子番茄红素合成相关基因的功能以及探讨牛奶子高产番茄红素的机制,对扩大番茄红素来源具有十分重要的意义。本实验室前期研究发现,牛奶子果实成熟过程中EutPsy等关键基因与EutIPI等蛋白的表达上调,推测EutPsy、EutIPI在牛奶子高产番茄红素的机制中有着重要的作用。本论文对EutIPI、EutPsy的基因功能进行了初步分析。主要研究结果如下：1.克隆了牛奶子10个管家基因的片段,从12个管家基因中筛选出不同情况下适用的内参基因：(1)确定eIF4A、RPL7、UBCE作为适合牛奶子所有样品的稳定内参基因；(2)确定UBCE、RPL7作为牛奶子不同器官间稳定的内参基因；(3)确定eIF4A、UBCE作为牛奶子果实成熟过程稳定的内参基因；(4)确定eIF4A、UBCE作为外源激素(ABA、GA3)处理牛奶子果实时稳定的内参基因；(5)确定Actin、EF1-α、eIF4A作为盐害、脱水非生物胁迫处理牛奶子时稳定的内参基因。2.利用实时定量PCR技术,分析了EutIPI的表达模式：(1)选用牛奶子果实成熟过程稳定的内参基因eIF4A、UBCE,评价果实成熟过程EutIPI的表达情况,发现与青果相比,黄果、红果中的EutIPI表达没有显著变化,而在粉果中EutIPI显著上调；(2)选用牛奶子器官中稳定的内参基因UBCE,评价叶、茎、花、根中EutIPI的表达情况,发现EutIPI在叶片表达较高,根中次之,茎与花中的表达量很低。3.利用颜色互补实验技术,完成了对EutIPI、EutPsy基因功能的初步分析：EutIPI能够使工程菌DH5α (pAC-EutIPI+pAC-BETA)的p-胡萝卜素含量增加,说明EutIPI在工程菌中能够提供更多的底物,促使工程菌大量合成p-胡萝卜素；EutPsy能够使工程菌TOP1OF'(PUC18-EutPsy+pAC-85b)产生β-胡萝卜素,说明EutPsy具有八氢番茄红素合成酶的活性。因此,确定了EutIPI、EutPsy参与类胡萝卜素的生物合成。4.克隆了EutIPI、EutPsy的DNA基因组全长及二者的部分启动子序列：EutIPI基因组全长为4025bp,包含6个外显子,5个内含子；EutPsy基因组全长为1311bp,不含内含子；利用TAIL-PCR克隆了758bp的EutPsy上游5'启动子序列、484bp的EutIPI上游5'启动子序列,均含有真核生物启动子的一般特征,包括TATA-element、CAAT-box等一系列应答元件。
【关键词】：牛奶子 内参基因 实时定量PCR 八氢番茄红素合成酶 异戊烯基磷酸异构酶 基因功能
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q943.2