| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 英文缩略语表 | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| ·萜类化合物概况 | 第11-12页 |
| ·定义 | 第11页 |
| ·分类 | 第11页 |
| ·生理活性 | 第11-12页 |
| ·萜类化合物前体的生物合成途径 | 第12-15页 |
| ·MVA途径 | 第12-13页 |
| ·MEP途径 | 第13-14页 |
| ·两条途径相互关系与研究MEP途径的意义 | 第14-15页 |
| ·MEP途径中关键酶DXS的研究进展 | 第15-19页 |
| ·DXS研究进展 | 第15-17页 |
| ·DXS晶体结构与关键氨基酸残基 | 第17-18页 |
| ·DXS催化磷酸丙糖异构化的活性 | 第18-19页 |
| ·定点突变技术 | 第19-21页 |
| ·SOE-PCR定点突变技术 | 第19-20页 |
| ·反向PCR定点突变技术 | 第20-21页 |
| ·本研究的意义 | 第21-22页 |
| 第二章 EcDXS诱导表达与纯化 | 第22-31页 |
| ·材料与仪器 | 第22-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·实验仪器 | 第22-23页 |
| ·主要试剂配方 | 第23-26页 |
| ·实验方法 | 第26-28页 |
| ·BL21(DE3)感受态细胞制备 | 第26页 |
| ·pET23bEcDXS质粒转化 | 第26-27页 |
| ·EcDXS诱导过表达 | 第27页 |
| ·亲和层析纯化EcDXS | 第27页 |
| ·DXS重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| ·酶标法(Bradford试剂)测定DXS蛋白浓度 | 第28页 |
| ·纸色谱法测定DXP的合成 | 第28页 |
| ·实验结果与讨论 | 第28-30页 |
| ·EcDXS诱导表达后SDS-PAGE检测 | 第28-29页 |
| ·Bradford法测定EcDXS浓度 | 第29-30页 |
| ·EcDXS转酮酶活性检测 | 第30页 |
| ·本章小结 | 第30-31页 |
| 第三章 柱前衍生-HPLC动态监测EcDXS催化磷酸丙糖异构化反应及DXP形成反应的反应过程 | 第31-44页 |
| ·材料与试剂 | 第31-32页 |
| ·实验仪器 | 第31页 |
| ·试剂 | 第31页 |
| ·试剂与缓冲液配方 | 第31-32页 |
| ·实验与方法 | 第32-36页 |
| ·待检测物质的2,4-二硝基苯肼衍生化预处理 | 第32-33页 |
| ·衍生化产物的HPLC分析 | 第33页 |
| ·HPLC检测D-GAP、DHAP与DXP | 第33页 |
| ·HPLC检测EcDXS催化D-GAP与DHAP可逆异构化反应 | 第33-34页 |
| ·HPLC检测EcDXS催化D-GAP或DHAP合成DXP | 第34页 |
| ·HPLC监测EcDXS催化转酮酶反应与磷酸丙糖异构化反应的竞争性 | 第34-36页 |
| ·以DHAP为底物 | 第34-35页 |
| ·以D-GAP为底物 | 第35-36页 |
| ·HPLC检测DXS利用丙酮酸的必要性 | 第36页 |
| ·实验结果与讨论 | 第36-43页 |
| ·GA-DNPH、DX-DNPH、DHA-DNPH的HPLC分析 | 第36-37页 |
| ·EcDXS催化D-GAP与DHAP异构化的HPLC分析 | 第37页 |
| ·DHAP作为DXS催化合成DXP的底物的HPLC检测 | 第37页 |
| ·EcDXS催化底物DHAP反应的HPLC监测结果 | 第37-42页 |
| ·丙酮酸浓度对EcDXS催化不同底物进行反应影响 | 第42-43页 |
| ·本章小结 | 第43-44页 |
| 第四章 关键氨基酸残基对EcDXS催化D-GAP/DHAP可逆异构化活性的影响 | 第44-61页 |
| ·材料与仪器 | 第44页 |
| ·菌株与载体 | 第44页 |
| ·工具酶、试剂与试剂盒 | 第44页 |
| ·溶液配制 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44页 |
| ·仪器 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-54页 |
| ·工程菌E.coli BL21(DE3)-pET23bEcDXS的扩增培养 | 第44-45页 |
| ·试剂盒(离心柱型)提取pET23bEcDXS质粒 | 第45页 |
| ·pET23bEcDXS质粒的双酶切与琼脂糖电泳检验 | 第45-46页 |
| ·尝试用SOE-PCR对dxs基因进行定点突变 | 第46-52页 |
| ·突变位点的选择 | 第46-48页 |
| ·引物的设计 | 第48页 |
| ·第一步PCR——待融合片段的扩增 | 第48-49页 |
| ·DNA片段在标准琼脂糖上的分离 | 第49-50页 |
| ·Kit凝胶回收片段PCR | 第50页 |
| ·第二步PCR——融合PCR反应 | 第50-51页 |
| ·尝试二次PCR对融合片段进行大量扩增 | 第51页 |
| ·构建重组质粒pET23bEcdxs427Q | 第51-52页 |
| ·质粒pET23bEcDXS427Q的测序鉴定 | 第52页 |
| ·KOD-Plus-Mutagenesis Kit构建突变质粒pET23bEcDXS49Q | 第52-54页 |
| ·突变位点的选择与引物设计 | 第52-53页 |
| ·反向PCR | 第53页 |
| ·Dpn Ⅰ消化模板质粒DNA | 第53页 |
| ·反向PCR产物自身环化 | 第53-54页 |
| ·定点突变质粒转化与筛选 | 第54页 |
| ·突变体的确认 | 第54页 |
| ·实验结果与讨论 | 第54-60页 |
| ·重组质粒双酶切后琼脂糖电泳检验结果 | 第54-55页 |
| ·待融合片段的凝胶电泳鉴定与回收 | 第55-56页 |
| ·融合片段凝胶电泳鉴定与回收 | 第56页 |
| ·融合片段二次扩增后凝胶电泳鉴定 | 第56-57页 |
| ·双酶切融合片段后凝胶电泳鉴定 | 第57-58页 |
| ·突变质粒双酶切凝胶电泳鉴定与测序鉴定 | 第58页 |
| ·反向PCR试剂盒构建突变质粒凝胶电泳鉴定 | 第58-60页 |
| ·本章小结 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
