| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-19页 |
| 第一章 大肠杆菌aroA基因突变株的构建 | 第19-42页 |
| 引言 | 第19-20页 |
| ·实验材料 | 第20-22页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第20-21页 |
| ·培养基 | 第21页 |
| ·酶及生化试剂 | 第21页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·引物合成与测序 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-34页 |
| ·大肠杆菌基因组的提取(CTAB法) | 第22-23页 |
| ·琼脂糖凝胶中DNA片段的回收(参照试剂盒QIAEXⅡ的说明书) | 第23页 |
| ·质粒提取 | 第23-24页 |
| ·感受态细胞(氯化钙转化法)的制备 | 第24页 |
| ·电击转化感受态细胞制备 | 第24-25页 |
| ·电击转化 | 第25页 |
| ·线性DNAAK的准备 | 第25-29页 |
| ·线性DNAAC的准备 | 第29-31页 |
| ·含有pKD46的E.coli BW25113电转化感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·线性DNA的转化及突变株的筛选 | 第32页 |
| ·突变株的鉴定 | 第32-34页 |
| ·结果 | 第34-39页 |
| ·含抗性盒的线性片段的获得 | 第34页 |
| ·突变株的筛选结果 | 第34-36页 |
| ·突变株的分子验证 | 第36-38页 |
| ·突变株的功能验证 | 第38-39页 |
| ·讨论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-42页 |
| 第二章 高抗草甘膦EPSPS基因克隆及酶动力学研究 | 第42-76页 |
| 引言 | 第42-43页 |
| ·实验材料 | 第43-47页 |
| ·土壤样品 | 第43-44页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44-45页 |
| ·酶及生化试剂 | 第45-46页 |
| ·主要仪器 | 第46页 |
| ·酶活检测相关溶液 | 第46-47页 |
| ·引物合成与测序 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-55页 |
| ·草甘膦污染土壤细菌总DNA提取和纯化 | 第47-48页 |
| ·宏基因组文库的建立 | 第48-50页 |
| ·草甘膦抗性重组子的筛选 | 第50页 |
| ·草甘膦抗性新基因RD aroA的草甘膦抗性检测 | 第50-51页 |
| ·RD aroA基因大肠杆菌表达载体的构建 | 第51-53页 |
| ·RD EPSPS蛋白表达产物SDS-PAGE分析 | 第53-54页 |
| ·RD EPSPS蛋白酶粗提 | 第54页 |
| ·RD EPSPS酶动力学分析 | 第54-55页 |
| ·实验结果与分析 | 第55-67页 |
| ·土壤细菌DNA的提取 | 第55-56页 |
| ·宏基因组文库的构建及EPSPS基因克隆 | 第56-60页 |
| ·草甘膦抗性片段的草甘膦耐受实验 | 第60-61页 |
| ·RD aroA基因表达载体的构建及表达 | 第61-63页 |
| ·RD EPSPS粗酶液的提取 | 第63页 |
| ·RD EPSPS酶动力学分析 | 第63-67页 |
| ·讨论 | 第67-72页 |
| ·土壤总DNA提取方案 | 第67-68页 |
| ·RD EPSPS的谱系及动力学参数分析 | 第68-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 第三章 草甘膦N-乙酰转移酶保守区预测及抗性相关位点鉴定 | 第76-95页 |
| 引言 | 第76-77页 |
| ·实验材料 | 第77-78页 |
| ·预测所用的生物信息网站及生物信息学软件 | 第77页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第77-78页 |
| ·酶及生化试剂 | 第78页 |
| ·主要仪器 | 第78页 |
| ·引物合成与测序 | 第78页 |
| ·实验方法 | 第78-82页 |
| ·gat基因保守区的预测 | 第78-79页 |
| ·gat基因的定点突变 | 第79页 |
| ·MT-GATS的草甘膦抗性实验 | 第79页 |
| ·MT-GATS蛋白的诱导表达 | 第79页 |
| ·MT-GATS蛋白的纯化 | 第79-81页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白的透析和浓缩 | 第81页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白定量 | 第81页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白的圆二色谱检测 | 第81-82页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白的荧光光谱检测 | 第82页 |
| ·实验结果 | 第82-88页 |
| ·gat基因保守区的预测 | 第82-83页 |
| ·gat基因的定点突变 | 第83-84页 |
| ·MT-GATS的草甘瞵抗性实验 | 第84-85页 |
| ·MT-GATS蛋白的诱导表达 | 第85页 |
| ·MT-GATS蛋白的纯化 | 第85-86页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白的圆二色谱检测 | 第86-87页 |
| ·MT-GATS纯化蛋白的荧光光谱检测 | 第87-88页 |
| ·讨论 | 第88-93页 |
| ·GAT保守位点与草甘膦抗性 | 第88-90页 |
| ·GAT保守区的空间位置 | 第90-91页 |
| ·S~(52)、I~(53)及P~(134)位点与草甘膦抗性相关的可能机制 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-95页 |
| 结论 | 第95-96页 |
| 文献综述 | 第96-128页 |
| 第一节 新型高抗草甘膦基因及其转基因作物的研究 | 第96-112页 |
| 第二节 宏基因组技术及其在环境微生物资源开发应用中的研究进展 | 第112-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 在读期间发表论文、申请专利情况 | 第129-130页 |
