| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-22页 |
| 缩略词简表 | 第22-23页 |
| 前言 | 第23-27页 |
| 第一章 SPAG4L生物学信息学分析和表达特点 | 第27-52页 |
| 1. 材料与设备 | 第27-29页 |
| ·主要试剂 | 第27-28页 |
| ·主要设备 | 第28-29页 |
| 2. 方法 | 第29-40页 |
| ·生物信息学分析 | 第29页 |
| ·NORTHERN BLOT | 第29-33页 |
| ·抽提睾丸组织RNA | 第29-30页 |
| ·将睾丸组织RNA进行逆转录,生成CDNA | 第30页 |
| ·PCR扩增CDNA,获得DNA探针 | 第30页 |
| ·地高辛标记DNA探针 | 第30-31页 |
| ·NORTHERN BLOT实验 | 第31-33页 |
| ·抽提各组织样本RNA | 第31页 |
| ·获得各样本组织RNA电泳 | 第31-32页 |
| ·将RNA从凝胶中转至硝酸纤维素滤膜 | 第32-33页 |
| ·NORTHERN BLOT杂交 | 第33页 |
| ·放射自显影并结果保存 | 第33页 |
| ·胎儿睾丸组织,成年男性睾丸组织中SPAG4L水平的RT-PCR分析 | 第33-36页 |
| ·抽提胎儿睾丸组织,新鲜男性睾丸组织样本总RNA | 第34页 |
| ·RT-PCR,获得胎儿睾丸组织,成年男性睾丸组织总CDNA | 第34-35页 |
| ·在CDNA中,加入特异性的SPAG4L引物进行PCR反应 | 第35页 |
| ·在CDNA中,加入特异性的GAPDH引物进行PCR反应 | 第35-36页 |
| ·将RT—PCR获得产物进行电泳 | 第36页 |
| ·原位杂交 | 第36-40页 |
| ·准备载玻片 | 第36-37页 |
| ·冰冻切片组织制备 | 第37页 |
| ·地高辛标记DNA探针 | 第37-39页 |
| ·DNA探针的获得 | 第37-38页 |
| ·抽提睾丸组织RNA | 第37-38页 |
| ·将睾丸组织RNA进行逆转录,生成CDNA | 第38页 |
| ·PCR扩增CDNA,获得DNA探针 | 第38页 |
| ·地高辛标记DNA探针 | 第38-39页 |
| ·预杂交 | 第39页 |
| ·原位杂交 | 第39-40页 |
| ·洗涤 | 第40页 |
| ·免疫检测 | 第40页 |
| 3. 结果 | 第40-48页 |
| ·SPAG4L是SUN基因家族的一个新成员 | 第40-44页 |
| ·NORTHERN BLOT实验 | 第44-45页 |
| ·SPAG4L的MRNA表达与睾丸成熟度相关 | 第45-46页 |
| ·人睾丸组织原位杂交 | 第46-48页 |
| 4 讨论 | 第48-52页 |
| 第二章:SPAG4L的原核表达和纯化 | 第52-74页 |
| 1 材料与试剂 | 第52-56页 |
| ·主要材料 | 第53页 |
| ·主要试剂 | 第53-56页 |
| ·WESTERN BLOT分析试剂 | 第53-55页 |
| ·蛋白纯化试剂配制 | 第55-56页 |
| 2 方法 | 第56-64页 |
| ·RT-PCR扩增SPAG4L 126—379BP的基因片段,获得所需DNA | 第56-58页 |
| ·抽提睾丸组织RNA | 第56-57页 |
| ·将获得的睾丸组织总RNA,进行逆转录,得到睾丸组织总CDNA | 第57页 |
| ·用睾丸总CDNA,进行PCR反应,体系如下 | 第57-58页 |
| ·PUCM-T-SPAG4L重组质粒构建 | 第58-64页 |
| ·RT-PCR产物验证 | 第58页 |
| ·大肠杆菌JM15感受态制备 | 第58页 |
| ·转化JM15细菌并验证 | 第58-59页 |
| ·上述1-8号PCR产物经20G/L琼脂糖电泳,并测序验证 | 第59-60页 |
| ·PQE-30-SPAG4L重组表达质粒的构建和鉴定 | 第60-63页 |
| ·将测序验证的PUCM-T-SPAG4L载体双酶切并连接表达载体PQE-30 | 第60-61页 |
| ·从验证的JM15细菌菌液中抽提质粒 | 第60页 |
| ·双酶切质粒,连接表达载体PQE-30 | 第60-61页 |
| ·重组质粒PQE-30—SPAG4L转化JM109细菌并验证 | 第61-63页 |
| ·制备感受态细菌JM15 | 第61页 |
| ·将重组质粒PQE-30—SPAG4L转化感受态JM1 5细菌 | 第61-62页 |
| ·从上述菌液中菌中抽提重组质粒PQE-30—SPAG4L,并酶切验证 | 第62-63页 |
| ·SPAG4L融合蛋白的诱导表达 | 第63页 |
| ·Western blot鉴定SPAG4L融合蛋白 | 第63-64页 |
| ·SPAG4L融合蛋白纯化 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-70页 |
| ·PUCM-T-SPAG4L重组质粒鉴定结果 | 第64-65页 |
| ·PQE-30-SPAG4L重组表达质粒双酶切鉴定 | 第65-66页 |
| ·6×HIS—SPAG4L融合蛋白的诱导表达 | 第66-67页 |
| ·WESTERN-BLOT鉴定6×HIS—SPAG4L融合蛋白 | 第67-68页 |
| ·SPAG4L-6×HIs融合蛋白的纯化结果 | 第68-70页 |
| 4 讨论 | 第70-74页 |
| 第三章:SPAG4L的亚细胞定位及其在减数分裂中的变化 | 第74-89页 |
| 1 主要试剂和材料 | 第74-75页 |
| 2 方法 | 第75-81页 |
| ·SPAG4L亚细胞定位 | 第75-80页 |
| ·RT-PCR扩增SPAG4L不同突变体的基因片段(AA1-220;AA52-230;AA221-379;AA1-51) | 第76页 |
| ·PUCM-T-SPAG4L重组质粒构建 | 第76-78页 |
| ·RT-PCR产物验证 | 第76页 |
| ·大肠杆菌感受态制备 | 第76-77页 |
| ·各突变体重组PUCM-T质粒,转化JM15细菌并验证 | 第77-78页 |
| ·PEGFP-N1-SPAG4L重组表达质粒的构建和鉴定 | 第78-79页 |
| ·将验证PUCM-T-SPAG4L双酶切并连接PEGFP-N1 | 第78-79页 |
| ·从验证JM15细菌中抽提质粒 | 第78-79页 |
| ·抽提获得质粒双酶切 | 第79页 |
| ·重组质粒PEGFP-N1—SPAG4L转化HELLA细胞并验证 | 第79-80页 |
| ·SPAG4L小鼠同源基因SPAG4L与核膜和内质网共定位的研究 | 第80页 |
| ·SPAG4L小鼠同源基因SPAG4L在小鼠精子减数分裂中的变化 | 第80-81页 |
| 3 结果 | 第81-85页 |
| ·SPA4GL不同突变体的亚细胞定位 | 第81-83页 |
| ·小鼠同源基因SPAG4L与核膜和内质网共定位 | 第83-84页 |
| ·SPAG4L小鼠同源基因SPAG4L,在小鼠精子减数分裂过程中的变化 | 第84-85页 |
| 4. 讨论 | 第85-89页 |
| 参考文献 | 第89-93页 |
| 综述:SUN家族研究进展 | 第93-104页 |
| 参考文献 | 第100-104页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105页 |
