| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 肿瘤的治疗 | 第13-15页 |
| 1.2 肿瘤与肿瘤微环境 | 第15-17页 |
| 1.3 肿瘤与人AGR2蛋白 | 第17-21页 |
| 1.3.1 AGR2蛋白的表达与分布 | 第17-18页 |
| 1.3.2 AGR2蛋白在肿瘤中的表达及功能 | 第18-21页 |
| 1.4 单克隆抗体治疗 | 第21-23页 |
| 1.4.1 肿瘤治疗性单克隆抗体药物现状 | 第21-22页 |
| 1.4.2 单克隆抗体药物治疗肿瘤的机制 | 第22页 |
| 1.4.3 抗体人源化技术 | 第22-23页 |
| 1.5 课题意义及研究内容 | 第23-25页 |
| 第二章 实验材料 | 第25-41页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第25-36页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.1.2 试剂的配制 | 第28-35页 |
| 2.1.3 实验细胞与动物 | 第35-36页 |
| 2.2 核酸引物序列 | 第36-38页 |
| 2.3 仪器 | 第38-40页 |
| 2.4 数据分析工具 | 第40-41页 |
| 第三章 方法、结果与分析 | 第41-113页 |
| 第一部分 鼠源AGR2抗体18A4的人源化和人源化抗体18A4HuI理化活性及抗肿瘤活性初步验证 | 第41-77页 |
| 3.1 实验方法 | 第41-59页 |
| 3.1.1 18A4杂交瘤细胞的培养与传代 | 第41页 |
| 3.1.2 18A4杂交瘤RNA提取、反转录及5’cDNA末端快速扩增技术获取18A4抗体可变区序列 | 第41-46页 |
| 3.1.3 18A4人源化分析 | 第46-47页 |
| 3.1.4 重叠PCR法产生人源化抗体18A4Hu可变区片段 | 第47-49页 |
| 3.1.5 运用pHAb-FAST质粒系统产生人源化抗体18A4Hu表达质粒 | 第49-51页 |
| 3.1.6 18A4Hu潜在免疫原性分析 | 第51页 |
| 3.1.7 18A4Hu突变体的产生 | 第51-52页 |
| 3.1.8 瞬时转染293T表达人源化抗体及突变体 | 第52-53页 |
| 3.1.9 人源化抗体及突变体的纯化 | 第53-54页 |
| 3.1.10 间接ELISA检测18A4Hu及突变体的抗原结合活性 | 第54-55页 |
| 3.1.11 竞争性ELISA检测抗体18A4与18A4Hu抗原表位和亲合力 | 第55-56页 |
| 3.1.12 SDS-PAGE检测抗体纯度和分子量大小及Western blot检测 | 第56-59页 |
| 3.2 结果与分析 | 第59-76页 |
| 3.2.1 18 A4抗体人源化可变区的产生 | 第59-63页 |
| 3.2.2 pHAb-FAST质粒系统的构建及人源化抗体18A4Hu表达质粒的产生 | 第63-66页 |
| 3.2.3 人源化抗体18A4HuT细胞潜在抗原位分析及抗原性降低的人源化单克隆抗体18A4Hu I的获得 | 第66-72页 |
| 3.2.4 最优人源化抗体18A4Hu I(18A4Hu-QRVM)理化性质分析 | 第72-75页 |
| 3.2.5 人源化抗体18A4Hu I能有效的抑制SKOV3 肿瘤的生长 | 第75-76页 |
| 3.3 第一部分小结 | 第76-77页 |
| 第二部分 AGR2在肿瘤形成和血管形成中的分子机制研究 | 第77-113页 |
| 3.4 实验方法 | 第77-87页 |
| 3.4.1 HUVEC细胞的培养与保存 | 第77页 |
| 3.4.2 THP-1 细胞的培养与巨噬细胞的诱导分化 | 第77-78页 |
| 3.4.3 小鼠腹腔免疫细胞的分离 | 第78页 |
| 3.4.4 HUVEC小室迁移实验 | 第78页 |
| 3.4.5 HUVEC细胞增殖实验 | 第78-79页 |
| 3.4.6 MCF7上清的收集 | 第79页 |
| 3.4.7 HUVEC细胞管状物形成实验 | 第79页 |
| 3.4.8 基质胶填充物体内血管形成实验 | 第79-80页 |
| 3.4.9 基质胶填充物血红蛋白浓度分析 | 第80页 |
| 3.4.10 信号通路蛋白磷酸化水平检测 | 第80-81页 |
| 3.4.11 免疫沉淀 | 第81页 |
| 3.4.12 免疫荧光和荧光共聚焦显微镜分析 | 第81页 |
| 3.4.13 光学传感器生物层干涉技术分析分子间相互作用 | 第81-83页 |
| 3.4.14 VEGF/bFGF二聚化实验 | 第83页 |
| 3.4.15 琼脂糖浓度梯度扩散点实验 | 第83页 |
| 3.4.16 实时荧光定量PCR法检测人源AGR2和鼠源AGR2的m RNA表达水平 | 第83-86页 |
| 3.4.17 肿瘤间隙液中AGR2的检测 | 第86页 |
| 3.4.18 裸鼠荷瘤实验 | 第86-87页 |
| 3.5 结果与分析 | 第87-111页 |
| 3.5.1 SKOV3 肿瘤形成过程中会诱导表达AGR | 第87-90页 |
| 3.5.2 AGR2能够促进VEGF和 bFGF的活性并通过与VEGF和 bFGF不同程度的crosstalk吸引血管内皮细胞和成纤维细胞 | 第90-94页 |
| 3.5.3 AGR2抗体18A4阻断AGR2可以有效降低AGR2对VEGF和 b FGF促血管活性的提高 | 第94-97页 |
| 3.5.4 AGR2对于VEGF和 bFGF的活性提高需要VEGF-VEGFR和b FGF-FGFR信号通路的存在 | 第97-100页 |
| 3.5.5 AGR2能够与VEGF及 bFGF结合,但不能与VEGF和 bFGF的受体结合 | 第100-104页 |
| 3.5.6 AGR2自身二聚化活性促进了与之结合的VEGF和 b FGF的同源二聚化 | 第104-107页 |
| 3.5.7 抗体阻断AGR2活性能有效降低肿瘤生长及肿瘤血管形成 | 第107-111页 |
| 3.6 第二部分小结 | 第111-113页 |
| 第四章 讨论、展望与结论 | 第113-119页 |
| 参考文献 | 第119-130页 |
| 附录 | 第130-146页 |
| 附录1 蛋白序列 | 第130-131页 |
| AGR2氨基酸序列 | 第130页 |
| 鼠18A4抗体轻链可变区氨基酸序列 | 第130页 |
| 鼠18A4抗体重链可变区氨基酸序列 | 第130-131页 |
| 人18A4Hu I抗体轻链可变区氨基酸序列 | 第131页 |
| 人18A4Hu I抗体重链可变区氨基酸序列 | 第131页 |
| 附录2 质粒序列 | 第131-146页 |
| pHAb-FAST质粒系统片段1 | 第131-138页 |
| pHAb-FAST质粒系统片段2 | 第138-141页 |
| 抗体轻链信号肽 | 第141-142页 |
| 抗体重链信号肽 | 第142页 |
| 抗体轻链恒定区 | 第142页 |
| 抗体重链恒定区 | 第142-143页 |
| 鼠18A4重链可变区 | 第143-144页 |
| 鼠18A4轻链可变区 | 第144页 |
| 人源化18A4Hu I重链可变区 | 第144-145页 |
| 人源化18A4Hu I轻链可变区 | 第145-146页 |
| 致谢 | 第146-148页 |
| 攻读博士学位期间发表、录用或提交的论文、专利及参加的学术会议 | 第148-149页 |
| 一、学术论文 | 第148页 |
| 二、专利 | 第148-149页 |
| 三、会议摘要 | 第149页 |
