| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| 1.1 亮氨酸脱氢酶的简介 | 第16-19页 |
| 1.1.1 亮氨酸脱氢酶的来源和分类 | 第16-17页 |
| 1.1.2 亮氨酸脱氢酶的结构简介 | 第17-19页 |
| 1.2 亮氨酸脱氢酶的催化应用研究 | 第19-26页 |
| 1.2.1 亮氨酸脱氢酶的转氨催化应用研究 | 第19-21页 |
| 1.2.2 亮氨酸脱氢酶的脱氨催化应用研究 | 第21-22页 |
| 1.2.3 亮氨酸脱氢酶在合成D-型氨基酸拓展应用研究 | 第22-26页 |
| 1.3 辅酶再生的研究现状 | 第26-27页 |
| 1.4 酶的定向进化 | 第27-28页 |
| 1.4.1 酶的改良 | 第27页 |
| 1.4.2 酶的定向进化研究 | 第27-28页 |
| 1.5 酶的高通量筛选方法研究 | 第28-34页 |
| 1.5.1 平板显色筛选法 | 第28-29页 |
| 1.5.2 96-孔板筛选法 | 第29-31页 |
| 1.5.3 细胞表面展示筛选法 | 第31-33页 |
| 1.5.4 微流控高通量筛选法 | 第33页 |
| 1.5.5 甘氨酸/triton x-100促进蛋白外泌在筛选体系中的研究 | 第33-34页 |
| 1.6 选题背景及研究意义 | 第34-35页 |
| 第二章 材料与方法 | 第35-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1.1 化学药品及仪器 | 第35页 |
| 2.1.2 菌种来源、质粒和引物 | 第35-36页 |
| 2.1.3 溶液的配置 | 第36-38页 |
| 2.2 基因工程的基本操作 | 第38-40页 |
| 2.2.1 质粒的提取 | 第38-39页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.3 DNA的纯化 | 第40页 |
| 2.2.4 化学转化感受态的制备与转化 | 第40页 |
| 2.3 重组质粒的构建 | 第40-44页 |
| 2.3.1 酶切连接法 | 第40-43页 |
| 2.3.2 Prolonged Overlap Extension PCR (POE-PCR) | 第43-44页 |
| 2.4 重组菌株的表达 | 第44-48页 |
| 2.4.1 重组菌株的表达和诱导 | 第44-45页 |
| 2.4.2 粗酶液的制备 | 第45页 |
| 2.4.3 重组蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| 2.4.4 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第46-48页 |
| 2.5 分析与测定方法 | 第48-50页 |
| 2.5.1 细胞干重的测定 | 第48页 |
| 2.5.2 蛋白浓度测定 | 第48-49页 |
| 2.5.3 蛋白酶活性的测定 | 第49-50页 |
| 2.6 产物的检测 | 第50-54页 |
| 2.6.1 D/L-叔亮氨酸的液相检测 | 第50-52页 |
| 2.6.2 α-酮异己酸的高效液相检测 | 第52-54页 |
| 第三章 亮氨酸脱氢酶的重组表达与酶学性质研究 | 第54-65页 |
| 3.1 亮氨酸脱氢酶的重组质粒构建与表达 | 第54-56页 |
| 3.2 亮氨酸脱氢酶酶的纯化 | 第56-57页 |
| 3.3 亮氨酸脱氢酶酶学性质分析 | 第57-60页 |
| 3.3.1 pH对酶活性的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.2 温度对酶活性的影响 | 第58-60页 |
| 3.4 酶动力学分析 | 第60-62页 |
| 3.5 底物谱分析 | 第62页 |
| 3.6 D-氨基酸对亮氨酸脱复酶活性的影响 | 第62-64页 |
| 3.7 本章小结 | 第64-65页 |
| 第四章 亮氨酸脱氢酶的定向进化 | 第65-83页 |
| 4.1 亮氨酸脱氢酶的高通量筛选方法的研究 | 第65-68页 |
| 4.1.1 番红O平板筛选方法 | 第65-67页 |
| 4.1.2 简化的96孔板筛选方法 | 第67-68页 |
| 4.2 亮氨酸脱氢酶高通量筛选方法的确立 | 第68-71页 |
| 4.2.1 甘氨酸及triton x-100协同作用的应用研究 | 第68-69页 |
| 4.2.2 亮氨酸脱氢酶的定向进化过程设计 | 第69-71页 |
| 4.3 随机突变文库的构建与筛选 | 第71-74页 |
| 4.4 突变子K172R的酶学性质测定与比较 | 第74-76页 |
| 4.4.1 突变子K172R的蛋白纯化 | 第74-75页 |
| 4.4.2 突变子K172R亮氨酸脱氢酶的活性测定 | 第75页 |
| 4.4.3 突变子K172R的动力学参数的测定 | 第75-76页 |
| 4.5 亮氨酸脱氢酶偶联乳酸脱氢酶催化合成α-酮异己酸 | 第76-80页 |
| 4.5.1 乳酸脱氢酶的酶学性质研究 | 第77-78页 |
| 4.5.2 双酶催化合成α-酮异己酸的初步实验 | 第78-80页 |
| 4.6 亮氨酸脱氢酶结构建模和突变子K172R的结构分析 | 第80-81页 |
| 4.7 本章小结 | 第81-83页 |
| 第五章 亮氨酸脱氢酶催化转氨合成L-叔亮氨酸的应用研究 | 第83-96页 |
| 5.1 亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶共表达体系的构建 | 第83-87页 |
| 5.1.1 单质粒融合表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的构建 | 第83-85页 |
| 5.1.2 单质粒共表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的构建 | 第85-87页 |
| 5.2 双酶偶联催化体系的比较及反应条件优化 | 第87-95页 |
| 5.2.1 双菌偶联共催化体系合成L-叔亮氨酸的研究 | 第87-89页 |
| 5.2.2 双质粒共表达催化体系合成L-叔亮氨酸的研究 | 第89-95页 |
| 5.3 本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 总结与展望 | 第96-99页 |
| 6.1 总结 | 第96-97页 |
| 6.2 展望 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 附录 | 第110-115页 |
| 附录一 主要试剂 | 第110-113页 |
| 附录二 主要仪器 | 第113-114页 |
| 附录三 本研究使用到的基因序列 | 第114-115页 |
