| 缩写词 | 第10-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-16页 |
| 第一章 引言 | 第17-32页 |
| 1 CRISPR/Cas9技术在植物中的研究进展 | 第17-26页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9的概况 | 第17-20页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现 | 第17-18页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的类型 | 第18页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas系统的基本结构特征 | 第18-19页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas系统的工作机理 | 第19-20页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统中Cas9和gRNA对植物基因编辑效率的影响 | 第20-25页 |
| 1.2.1 基因编辑效率与Cas9和gRNA及其启动子类型的关系 | 第20页 |
| 1.2.2 Cas9核酸酶启动子的类型对编辑效率的影响 | 第20-21页 |
| 1.2.3 gRNA启动子的类型对植物编辑效率的影响 | 第21页 |
| 1.2.4 gRNA靶标数目对植物基因组编辑效率的影响 | 第21-25页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9系统在植物上的应用及研究进展 | 第25-26页 |
| 2 乙烯信号转导的研究进展 | 第26-30页 |
| 2.1 乙烯信号转导相关基因 | 第27-29页 |
| 2.1.1 乙烯受体基因 | 第27-28页 |
| 2.1.2 铜离子转运基因 | 第28页 |
| 2.1.3 EIN2 | 第28页 |
| 2.1.4 EIN3/EILS | 第28-29页 |
| 2.1.5 ERFs | 第29页 |
| 2.2 文心兰中乙烯信号转导相关基因的研究进展 | 第29-30页 |
| 3 EIN2基因的研究进展 | 第30页 |
| 4 本研究的意义和主要内容 | 第30-32页 |
| 4.1 本研究的意义 | 第30-31页 |
| 4.2 本文研究的主要内容 | 第31-32页 |
| 4.2.1 文心兰OnEIN2基因的克隆与生物信息学分析 | 第31页 |
| 4.2.2 文心兰OnEIN2基因表达模式分析 | 第31页 |
| 4.2.3 CRISPR/Cas9表达载体的构建及转化文心兰组织 | 第31-32页 |
| 第二章 文心兰OnEIN2基因的克隆及生物信息学分析 | 第32-45页 |
| 第一节 文心兰EIN2基因的克隆 | 第32-37页 |
| 1 材料与方法 | 第32-34页 |
| 1.1 材料 | 第32-33页 |
| 1.2 方法 | 第33-34页 |
| 1.2.1 文心兰总RNA的提取及其cDNA第一链合成 | 第33页 |
| 1.2.2 文心兰EIN2基因的筛选与克隆 | 第33-34页 |
| 2 结果与分析 | 第34-36页 |
| 2.1 文心兰OnEIN2基因的克隆 | 第34-35页 |
| 2.2 文心兰OnEIN2基因的同源性分析 | 第35-36页 |
| 2.2.1 OnEIN2基因核苷酸序列同源性分析 | 第35页 |
| 2.2.2 OnEIN2基因氨基酸序列同源性分析 | 第35-36页 |
| 2.3 OnEIN2基因结构分析 | 第36页 |
| 3 讨论 | 第36-37页 |
| 第二节 文心兰EIN2基因的生物信息学分析 | 第37-45页 |
| 1 材料与方法 | 第37-38页 |
| 1.1 材料 | 第37页 |
| 1.2 方法 | 第37-38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-43页 |
| 2.1 OnEIN2基本理化性质的预测与分析 | 第38页 |
| 2.2 OnEIN2蛋白信号肽预测与亚细胞定位 | 第38-39页 |
| 2.3 OnEIN2蛋白质跨膜结构预测 | 第39-40页 |
| 2.4 OnEIN2磷酸化位点预测分析 | 第40页 |
| 2.5 OnEIN2保守结构域预测与分析 | 第40-41页 |
| 2.6 OnEIN2卷曲螺旋结构的分析 | 第41页 |
| 2.7 OnEIN2二级结构分析与三维结构预测 | 第41-42页 |
| 2.8 OnEIN2系统进化树分析 | 第42-43页 |
| 3 讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 文心兰OnEIN2基因表达模式分析 | 第45-57页 |
| 第一节 OnEIV2基因在文心兰不同组织部位和不同花期的表达分析 | 第45-49页 |
| 1 材料与方法 | 第45-46页 |
| 1.1 材料 | 第45页 |
| 1.2 方法 | 第45-46页 |
| 1.2.1 RNA的提取及cDNA逆转录 | 第45-46页 |
| 1.2.2 qPCR分析 | 第46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-48页 |
| 2.1 OnEIN2在不同组织部位中的表达分析 | 第46-47页 |
| 2.2 OnEIN2在文心兰不同花期中的表达分析 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 第二节 激素和非生物胁迫处理下文心兰OnEIN2基因的表达分析 | 第49-57页 |
| 1 材料与方法 | 第49-50页 |
| 1.1 材料 | 第49页 |
| 1.2 方法 | 第49-50页 |
| 1.2.1 试验材料的处理 | 第49-50页 |
| 1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 | 第50页 |
| 1.2.3 数据分析 | 第50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-55页 |
| 2.1 不同激素处理下OnEIN2的表达模式 | 第50-53页 |
| 2.1.1 生长素处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第50页 |
| 2.1.2 赤霉素处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第50-51页 |
| 2.1.3 脱落酸处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第51页 |
| 2.1.4 细胞分裂素处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第51-52页 |
| 2.1.5 水杨酸处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第52页 |
| 2.1.6 茉莉酸甲酯处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第52-53页 |
| 2.1.7 乙烯利处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第53页 |
| 2.2 非生物胁迫处理下OnEIN2的表达模式 | 第53-55页 |
| 2.2.1 盐胁迫处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第53-54页 |
| 2.2.2 聚乙二醇处理下文心兰OnEIN2的表达模式 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-57页 |
| 3.1 文心兰OnEIN2可能响应植物激素调控 | 第55-56页 |
| 3.2 文心兰OnEIN2可能参与文心兰胁迫反应 | 第56-57页 |
| 第四章 利用CRISPR/Cas9编辑文心兰EIN2基因的初步研究 | 第57-90页 |
| 第一节 文心兰愈伤组织的诱导和原生质体的分离 | 第57-63页 |
| 1 材料与方法 | 第58-60页 |
| 1.1 材料 | 第58-60页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第58页 |
| 1.1.2 试剂与仪器 | 第58-60页 |
| 1.2 方法 | 第60页 |
| 1.2.1 愈伤组织诱导的方法 | 第60页 |
| 1.2.2 原生质体分离的方法 | 第60页 |
| 1.3 愈伤组织的培养基 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-62页 |
| 2.1 愈伤组织的诱导 | 第60-61页 |
| 2.2 原生质体的分离 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-63页 |
| 第二节 CRISPR/Cas9定点突变体系的构建 | 第63-72页 |
| 1 材料与方法 | 第63-66页 |
| 1.1 试验材料 | 第63-64页 |
| 1.2 方法 | 第64-66页 |
| 1.2.1 CRISPREIN2-g1载体的获得 | 第64页 |
| 1.2.2 pABI-3载体的获得 | 第64-66页 |
| 1.2.3 pGKI-EIN2-gfpgus 8-11载体的构建 | 第66页 |
| 1.2.4 表达载体转化农杆菌 | 第66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-71页 |
| 2.1 靶位点的选择 | 第66-67页 |
| 2.2 CRISPREIN2-g1载体的构建 | 第67-68页 |
| 2.3 pAB1-3载体的构建及鉴定 | 第68-69页 |
| 2.4 pGKI-EIN2-gfpgus 8-11载体的获得 | 第69-71页 |
| 2.5 表达载体转化农杆菌 | 第71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 第三节 OnEIN2的CRISPR/Cas9表达载体转化文心兰原生质体 | 第72-81页 |
| 1 材料与方法 | 第72-76页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第72-73页 |
| 1.1.1 材料 | 第72页 |
| 1.1.2 试剂与工具 | 第72-73页 |
| 1.2 方法 | 第73-76页 |
| 1.2.1 原生质体的PEG转化 | 第73页 |
| 1.2.2 激光共聚焦显微镜观察 | 第73页 |
| 1.2.3 转基因原生质体的GUS和Cas9基因的检测 | 第73-74页 |
| 1.2.4 转化后原生质体的qPCR检测 | 第74页 |
| 1.2.5 转化后原生质体的HRM检测 | 第74-76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-80页 |
| 2.1 转基因原生质体的GFP观察 | 第76-77页 |
| 2.2 转基因原生质体中Cas9和GUS基因的检测 | 第77页 |
| 2.3 转基因原生质体中GUS表达量的变化 | 第77-78页 |
| 2.4 转基因原生质体中Cas9表达量的变化 | 第78页 |
| 2.5 转基因原生质体中OnEIN2表达量的变化 | 第78-79页 |
| 2.6 转基因原生质体的HRM检测 | 第79-80页 |
| 3 讨论 | 第80-81页 |
| 第四节 OnEIN2的CRISPR/Cas9表达载体转化文心兰原球茎和愈伤组织等组织材料 | 第81-90页 |
| 1 材料与方法 | 第81-83页 |
| 1.1 材料 | 第81页 |
| 1.1.1 受体材料 | 第81页 |
| 1.1.2 重组载体 | 第81页 |
| 1.2 方法 | 第81-83页 |
| 1.2.0 农杆菌菌液的制备及侵染材料的预处理 | 第81-82页 |
| 1.2.1 农杆菌对文心兰PLBs、愈伤组织和叶片的侵染 | 第82页 |
| 1.2.2 转基因PLBs和愈伤组织的GUS化学染色检测 | 第82页 |
| 1.2.3 转基因原生质体中Cas9和GUS基因的检测 | 第82页 |
| 1.2.4 转化后PLBs、愈伤组织和叶片的qPCR检测 | 第82-83页 |
| 1.2.5 转化后PLBs、愈伤组织和叶片的HRM检测 | 第83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-89页 |
| 2.1 转基因PLBs、愈伤组织和叶片的GUS化学染色 | 第83页 |
| 2.2 转基因PLBs、愈伤组织和叶片的Cas9和GUS基因的检测 | 第83-84页 |
| 2.3 转基因PLBs、愈伤组织和叶片中GUS表达量的变化 | 第84-85页 |
| 2.4 转基因PLBs、愈伤组织和叶片中Cas9表达量的变化 | 第85页 |
| 2.5 转基因PLBs、愈伤组织和叶片中OnEIN2表达量的变化 | 第85-86页 |
| 2.6 转基因PLBs、愈伤组织和叶片的HRM检测 | 第86-89页 |
| 3 讨论 | 第89-90页 |
| 第五章 总结与展望 | 第90-93页 |
| 1 结论 | 第90-91页 |
| 1.1 克隆出文心兰EIN2基因的cDNA全长序列与生物信息学分析 | 第90页 |
| 1.2 OnEIN2对文心兰不同组织部位、花期以及不同激素和非生物胁迫处理下的表达差异明显 | 第90-91页 |
| 1.2.1 文心兰不同组织部位和花期中OnEIN2表达量差异显著 | 第90-91页 |
| 1.2.2 文心兰OnEIN2在不同激素和生物胁迫下表达差异明显 | 第91页 |
| 1.3 利用CRISPR/Cas9对文心兰OnEIN2基因进行编辑的初步分析 | 第91页 |
| 2 展望 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 附录 文心兰OnEIN2基因cDNA序列 | 第101-103页 |
| 硕士期间发表论文情况 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
