| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒致病和免疫抑制机理的研究进展 | 第18-54页 |
| 1 PRRSV的基因组结构特征 | 第18-21页 |
| 1.1 Nsp2 | 第19页 |
| 1.2 GP5 | 第19-20页 |
| 1.3 核衣壳蛋白(N蛋白) | 第20-21页 |
| 2 PRRSV的致病性和免疫原性 | 第21-24页 |
| 2.1 PRRSV的致病性 | 第21-23页 |
| 2.2 PRRSV的免疫原性 | 第23-24页 |
| 3 宿主免疫应答 | 第24-29页 |
| 3.1 PRRSV引起的先天性免疫应答 | 第24-27页 |
| 3.1.1 PRRSV能够干扰体内外干扰素的产生 | 第24-25页 |
| 3.1.2 抑制IFN产生和IFN通路的PRRSV蛋白 | 第25-26页 |
| 3.1.3 不同毒株和细胞的IFN产生情况 | 第26-27页 |
| 3.2 PRRSV引起的宿主体液应答 | 第27-29页 |
| 4 PRRSV引起的炎性反应 | 第29-33页 |
| 4.1 PRRSV引起的促炎性反应和抗炎性反应 | 第29-31页 |
| 4.2 PRRS发病中促炎性细胞因子的分泌 | 第31-33页 |
| 5 PRRSV感染性克隆的发展与应用 | 第33-34页 |
| 6 PRRSV的疫苗研究进展 | 第34-36页 |
| 6.1 弱毒活疫苗 | 第34-35页 |
| 6.2 灭活疫苗 | 第35页 |
| 6.3 新型疫苗 | 第35-36页 |
| 7 结语 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-54页 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801株的传代致弱与全基因序列分析 | 第54-72页 |
| 1 材料与方法 | 第55-59页 |
| 1.1 细胞与病毒 | 第55页 |
| 1.2 病毒传代与基因测序 | 第55-56页 |
| 1.3 PRRSV全基因组基因进化树和重组信号分析 | 第56-57页 |
| 1.4 各代次病毒全基因组序列比对及配对比较 | 第57页 |
| 1.5 动物实验验证病毒毒力致弱 | 第57页 |
| 1.5.1 病毒攻毒实验 | 第57页 |
| 1.5.2 病理学检查 | 第57页 |
| 1.6 病理切片制备 | 第57-58页 |
| 1.6.1 病理组织切片的制备 | 第57-58页 |
| 1.6.2 切片染色 | 第58页 |
| 1.7 实时定量RT-PCR | 第58-59页 |
| 1.7.1 样品总RNA提取 | 第58页 |
| 1.7.2 cDNA | 第58页 |
| 1.7.3 SYBR Green实时PCR检测猪血清中PRRSV mRNA量 | 第58-59页 |
| 1.8 数据分析 | 第59页 |
| 2 结果 | 第59-64页 |
| 2.1 攻毒后临床症状和病毒血症 | 第59-60页 |
| 2.2 NT0801毒株的全基因测序 | 第60-62页 |
| 2.3 NT0801毒株各代次病毒的氨基酸序列差异分析 | 第62页 |
| 2.4 各亲本/致弱病毒组之间的变异频率比较 | 第62-64页 |
| 2.5 潜在的毒力基因分析 | 第64页 |
| 3 讨论 | 第64-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NT0801株与BB0907株的感染性CDNA克隆构建 | 第72-88页 |
| 1 材料与方法 | 第73-79页 |
| 1.1 病毒与试剂 | 第73页 |
| 1.2 引物设计 | 第73-74页 |
| 1.3 病毒RNA的提取 | 第74-75页 |
| 1.4 RT-PCR扩増各片段 | 第75-76页 |
| 1.5 DNA胶回收 | 第76页 |
| 1.6 中间重组质粒的克隆 | 第76-77页 |
| 1.6.1 连接 | 第76页 |
| 1.6.2 转化 | 第76-77页 |
| 1.6.3 阳性重组子的鉴定和测序 | 第77页 |
| 1.7 质粒的提取 | 第77页 |
| 1.8 全长感染性cDNA克隆质粒的构建 | 第77-78页 |
| 1.9 转染与病毒拯救 | 第78页 |
| 1.10 间接免疫荧光(IFA) | 第78-79页 |
| 1.11 空斑实验 | 第79页 |
| 1.12 基因标记的鉴定 | 第79页 |
| 1.13 生长曲线的测定 | 第79页 |
| 2 结果 | 第79-82页 |
| 2.1 NT0801和BB0907株各片段的扩增 | 第79-80页 |
| 2.2 全长cDNA克隆质粒的获得鉴定 | 第80页 |
| 2.3 质粒转染及病毒拯救 | 第80-81页 |
| 2.4 间接免疫荧光(IFA) | 第81页 |
| 2.5 空斑实验 | 第81页 |
| 2.6 基因标记的鉴定 | 第81-82页 |
| 2.7 生长曲线 | 第82页 |
| 3 讨论 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-88页 |
| 第四章 PRRSV核衣壳蛋白N端非共价区域对IL-10表达的上调作用 | 第88-122页 |
| 1 材料与方法 | 第89-102页 |
| 1.1 质粒,病毒,细胞与试剂 | 第89-90页 |
| 1.2 Genome Walking扩增IL-10启动子基因 | 第90-91页 |
| 1.2.1 特异性引物的设计 | 第90页 |
| 1.2.2 猪全基因组DNA的获取 | 第90页 |
| 1.2.3 巢式PCR扩增IL-10启动子 | 第90-91页 |
| 1.2.4 IL-10启动子基因的克隆与测序 | 第91页 |
| 1.3 IL-10启动子序列的分析 | 第91页 |
| 1.4 IL-10启动子报告基因的构建 | 第91-93页 |
| 1.4.1 引物的设计 | 第91-92页 |
| 1.4.2 IL-10启动子基因的扩增 | 第92页 |
| 1.4.3 IL-10启动子基因克隆至pGL3 -Basic载体中 | 第92-93页 |
| 1.5 双荧光报告基因(Luciferase)检测系统验证IL-10启动子活性 | 第93-94页 |
| 1.5.1 质粒的转染 | 第93页 |
| 1.5.2 LPS刺激 | 第93页 |
| 1.5.3 荧光素酶活性的测定 | 第93-94页 |
| 1.6 MoDCs的制备 | 第94页 |
| 1.7 PRRSV在MoDCs细胞上的生长特性 | 第94页 |
| 1.8 ELISA测定PRRSV感染MoDCs后IL-10蛋白水平 | 第94页 |
| 1.9 N蛋白真核表达质粒的构建 | 第94-96页 |
| 1.9.1 引物设计 | 第94页 |
| 1.9.2 N蛋白基因的扩增 | 第94-95页 |
| 1.9.3 N蛋白基因的真核表达载体的克隆 | 第95-96页 |
| 1.10 N蛋白截断体,突变体真核表达载体的构建 | 第96-99页 |
| 1.11 Western-blotting | 第99-100页 |
| 1.12 利用NT0801毒株感染性cDNA克隆构建相应的突变体和回复体 | 第100-101页 |
| 1.13 RT-PCR及测序鉴定 | 第101-102页 |
| 1.14 病毒空斑实验及生长曲线测定 | 第102页 |
| 1.15 ELISA测定重组病毒感染MoDCs后细胞因子水平 | 第102页 |
| 1.16 数据分析 | 第102页 |
| 2 结果 | 第102-113页 |
| 2.1 猪IL-10启动子克隆及其荧光素酶报告基因的构建和活性验证 | 第102-105页 |
| 2.1.1 染色体步移法扩增猪IL-10启动子基因 | 第102-103页 |
| 2.1.2 IL-10启动子荧光素酶报告载体的构建 | 第103-104页 |
| 2.1.3 LPS刺激3D4/2细胞促使pIL-10的活性上调 | 第104-105页 |
| 2.1.4 PRRSV刺激MARC-145细胞促使pIL-10的活性上调 | 第105页 |
| 2.2 PRRSV感染MoDCs后对IL-10蛋白水平的上调 | 第105-106页 |
| 2.2.1 PRRSV在MoDCs上的生长曲线测定 | 第105页 |
| 2.2.2 PRRSV感染MoDCs后IL-10蛋白水平的测定 | 第105-106页 |
| 2.3 PRRSV核衣壳(N)蛋白对pIL-10的上调作用 | 第106-108页 |
| 2.3.1 N蛋白真核表达载体的构建与表达验证 | 第106-107页 |
| 2.3.2 N蛋白对IL-10启动子活性的上调作用 | 第107页 |
| 2.3.3 N蛋白表达时间和计量对IL-10启动子活性上调的影响 | 第107-108页 |
| 2.4 N蛋白突变体的构建及其对IL-10启动子的作用 | 第108-109页 |
| 2.5 PRRSVNT0801株感染性cDNA克隆突变体的构建与病毒拯救及鉴定 | 第109-110页 |
| 2.6 PRRSV突变病毒对IL-10启动子活性的影响 | 第110-111页 |
| 2.7 PRRSV突变病毒感染MoDCs后对IL-10蛋白水平的影响 | 第111-112页 |
| 2.8 PRRSV突变病毒感染MoDCs后其他促炎性因子（TNF-α，IL-lβ，IL-6)蛋白水平的变化 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-122页 |
| 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2 323-433和628-747位氨基酸残基体外对炎性反应的影响 | 第122-142页 |
| 1 材料与方法 | 第123-129页 |
| 1.1 细胞和病毒 | 第123页 |
| 1.2 肺泡巨噬细胞(PAMs)的制备 | 第123-124页 |
| 1.3 PRRSV全长重组质粒的构建 | 第124-126页 |
| 1.4 重组病毒的拯救 | 第126页 |
| 1.5 重组病毒的鉴定 | 第126-127页 |
| 1.5.1 重组病毒传代过程中的稳定性 | 第126-127页 |
| 1.5.2 间接免疫荧光(IFA) | 第127页 |
| 1.5.3 病毒空斑实验和生长曲线测定 | 第127页 |
| 1.6 病毒接种PAMs | 第127页 |
| 1.7 实时定量RT-PCR测定炎性因子 | 第127-128页 |
| 1.8 ELISA测定炎性因子 | 第128页 |
| 1.9 Western-blotting | 第128-129页 |
| 1.10 数据分析 | 第129页 |
| 2 结果 | 第129-134页 |
| 2.1 重组病毒的拯救与鉴定 | 第129-130页 |
| 2.2 重组病毒在PAMs上的生长特性 | 第130-131页 |
| 2.3 重组病毒感染PAMs后炎性因子mRNA量 | 第131-132页 |
| 2.4 重组病毒感染PAMs后炎性因子蛋白量 | 第132-133页 |
| 2.5 PRRSV感染PAMs后激活NF-κB和AP-1通路 | 第133-134页 |
| 3 讨论 | 第134-136页 |
| 参考文献 | 第136-142页 |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失毒株的构建与鉴定 | 第142-158页 |
| 1 材料与方法 | 第143-147页 |
| 1.1 病毒和试剂 | 第143页 |
| 1.2 质粒的构建 | 第143-146页 |
| 1.3 质粒转染与病毒拯救 | 第146页 |
| 1.4 间接免疫荧光(IFA) | 第146页 |
| 1.5 生长曲线的测定 | 第146页 |
| 1.6 病毒空斑实验 | 第146页 |
| 1.7 RT-PCR和GP5基因测序鉴定 | 第146页 |
| 1.8 Western-blotting | 第146页 |
| 1.9 PAMs感染 | 第146-147页 |
| 1.10 数据分析 | 第147页 |
| 2 结果 | 第147-152页 |
| 2.1 PRRSV GP5单一糖基化位点缺失不影响病毒拯救 | 第147-148页 |
| 2.2 PRRSV GP5多个糖基化位点缺失病毒的拯救 | 第148-149页 |
| 2.3 GP5糖基化位点缺失体病毒传代过程中的稳定性 | 第149-150页 |
| 2.4 突变病毒中GP5糖基化位点的鉴定 | 第150-151页 |
| 2.5 PRRSV GP5糖基化位点缺失体在PAMs中的复制 | 第151-152页 |
| 3 讨论 | 第152-154页 |
| 参考文献 | 第154-158页 |
| 第七章 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5糖基化位点缺失毒株灭活疫苗免疫保护作用 | 第158-172页 |
| 1 材料与方法 | 第159-161页 |
| 1.1 细胞和病毒 | 第159页 |
| 1.2 实验动物 | 第159页 |
| 1.3 灭活疫苗制备 | 第159-160页 |
| 1.4 小鼠免疫试验 | 第160页 |
| 1.5 猪体免疫保护试验 | 第160页 |
| 1.6 PRRSV ELISA抗体检测 | 第160页 |
| 1.7 PRRSV中和抗体测定 | 第160-161页 |
| 1.8 Real-time PCR检测血清中PRRSV含量 | 第161页 |
| 1.9 临床症状及肺脏大体病变统计方法 | 第161页 |
| 1.10 病理切片制备 | 第161页 |
| 1.11 数据统计分析 | 第161页 |
| 2 结果 | 第161-166页 |
| 2.1 小鼠免疫试验结果 | 第161-163页 |
| 2.1.1 PRRSV特异性抗体检测 | 第161-162页 |
| 2.1.2 PRRSV中和抗体 | 第162-163页 |
| 2.2 猪体免疫保护试验结果 | 第163-166页 |
| 2.2.1 PRRSV特异性抗体检测 | 第163页 |
| 2.2.2 PRRSV中和抗体 | 第163-164页 |
| 2.2.3 攻毒后临床症状观察 | 第164页 |
| 2.2.4 病毒血症 | 第164-165页 |
| 2.2.5 病理变化 | 第165-166页 |
| 3 讨论 | 第166-167页 |
| 参考文献 | 第167-172页 |
| 全文总结 | 第172-174页 |
| 本论文主要创新点 | 第174-176页 |
| 致谢 | 第176-178页 |
| 攻读博士期间发表论文 | 第178页 |
