| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 英文缩略词及中文对照表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-41页 |
| 1.1 环氧氯丙烷概述 | 第18-19页 |
| 1.2 手性ECH的合成方法 | 第19-24页 |
| 1.2.1 化学法合成手性ECH | 第19-20页 |
| 1.2.2 生物酶法合成手性ECH | 第20-24页 |
| 1.3 环氧化物水解酶 | 第24-34页 |
| 1.3.1 环氧化物水解酶的结构及催化机理 | 第25-26页 |
| 1.3.2 环氧化物水解酶的应用 | 第26-29页 |
| 1.3.3 环氧化物水解酶的开发 | 第29-31页 |
| 1.3.4 环氧化物水解酶的分子改造 | 第31-34页 |
| 1.4 卤醇脱卤酶 | 第34-39页 |
| 1.4.1 卤醇脱卤酶的结构和催化机理 | 第34-35页 |
| 1.4.2 卤醇脱卤酶的筛选与克隆 | 第35-36页 |
| 1.4.3 卤醇脱卤酶的应用 | 第36-38页 |
| 1.4.4 卤醇脱卤酶的分子改造 | 第38-39页 |
| 1.5 本论文的研究研究目的及意义 | 第39-40页 |
| 1.6 本论文的主要研究内容 | 第40-41页 |
| 第二章 卤醇脱卤酶的挖掘与表征 | 第41-69页 |
| 2.1 引言 | 第41页 |
| 2.2 实验材料 | 第41-43页 |
| 2.2.1 主要设备与仪器 | 第41-42页 |
| 2.2.2 菌株与质粒 | 第42页 |
| 2.2.3 酶与试剂 | 第42-43页 |
| 2.2.4 引物 | 第43页 |
| 2.3 实验方法 | 第43-49页 |
| 2.3.1 培养基及常用试剂配制 | 第43-44页 |
| 2.3.2 产卤醇脱卤酶菌株的筛选与鉴定 | 第44-45页 |
| 2.3.3 基本分子生物学方法 | 第45页 |
| 2.3.4 卤醇脱卤酶基因的克隆 | 第45-46页 |
| 2.3.5 卤醇脱卤酶大肠杆菌表达载体和工程菌的构建 | 第46页 |
| 2.3.6 卤醇脱卤酶的诱导表达 | 第46页 |
| 2.3.7 氨基酸序列比对与系统进化分析 | 第46-47页 |
| 2.3.8 卤醇脱卤酶的分离纯化 | 第47页 |
| 2.3.9 卤醇脱卤酶酶学性质表征 | 第47-48页 |
| 2.3.10 卤醇脱卤酶酶活测定 | 第48页 |
| 2.3.11 分析方法 | 第48-49页 |
| 2.3.12 卤醇脱卤酶催化 1,3-DCP合成手性ECH | 第49页 |
| 2.3.13 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE合成(R)-HN | 第49页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第49-67页 |
| 2.4.1 产卤醇脱卤酶的筛选及鉴定 | 第49页 |
| 2.4.2 HheA_(Am)基因的克隆与序列分析 | 第49-50页 |
| 2.4.3 HHDH_(Tm)的基因的克隆与序列分析 | 第50-51页 |
| 2.4.4 其它卤醇脱卤酶的克隆与序列分析 | 第51-53页 |
| 2.4.5 卤醇脱卤酶进化分析 | 第53-54页 |
| 2.4.6 卤醇脱卤酶的表达 | 第54-56页 |
| 2.4.7 重组卤醇脱卤酶的筛选 | 第56页 |
| 2.4.8 重组卤醇脱卤酶的分离纯化 | 第56-57页 |
| 2.4.9 卤醇脱卤酶的酶学性质研究 | 第57-64页 |
| 2.4.10 卤醇脱卤酶催化 1,3-DCP合成手性ECH | 第64-65页 |
| 2.4.11 卤醇脱卤酶催化拆分ECH合成手性ECH | 第65-66页 |
| 2.4.12 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE合成(R)-HN | 第66-67页 |
| 2.5 本章小结 | 第67-69页 |
| 第三章 环氧化物水解的酶的挖掘与表征 | 第69-88页 |
| 3.1 引言 | 第69-70页 |
| 3.2 实验材料 | 第70-71页 |
| 3.2.1 菌株及质粒 | 第70页 |
| 3.2.2 酶与试剂 | 第70页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第70页 |
| 3.2.4 引物 | 第70-71页 |
| 3.3 实验方法 | 第71-74页 |
| 3.3.1 培养基 | 第71页 |
| 3.3.2 基因组DNA的提取 | 第71页 |
| 3.3.3 基本分子生物学方法 | 第71页 |
| 3.3.4 环氧化物水解酶基因克隆 | 第71-73页 |
| 3.3.5 重组环氧化物水解酶的诱导表达 | 第73页 |
| 3.3.6 重组环氧化物水解酶的分离纯化 | 第73页 |
| 3.3.7 分析方法 | 第73页 |
| 3.3.8 环氧化物水解酶酶活测定 | 第73页 |
| 3.3.9 重组环氧化物水解酶酶学性质表征 | 第73页 |
| 3.3.10 重组细胞催化拆分合成手性ECH的研究 | 第73-74页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第74-87页 |
| 3.4.1 AmEH基因的克隆及序列分析 | 第74-76页 |
| 3.4.2 AmEH在大肠杆菌中的异源表达 | 第76-77页 |
| 3.4.3 PlEH1和PlEH2基因克隆与序列分析 | 第77-78页 |
| 3.4.4 PlEH1和PlEH2的诱导表达 | 第78-79页 |
| 3.3.5 重组环氧化物水解酶的筛选 | 第79-80页 |
| 3.4.6 重组环氧化物水解酶分离纯化 | 第80页 |
| 3.4.7 环氧化物水解酶酶学性质研究 | 第80-86页 |
| 3.4.8 环氧化物水解酶拆分外消旋ECH | 第86-87页 |
| 3.5 本章小结 | 第87-88页 |
| 第四章 卤醇脱卤酶立体选择性的分子改造研究 | 第88-105页 |
| 4.1 引言 | 第88-89页 |
| 4.2 材料 | 第89-90页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第89页 |
| 4.2.2 酶与试剂 | 第89页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第89页 |
| 4.2.4 引物 | 第89-90页 |
| 4.3 实验方法 | 第90-92页 |
| 4.3.1 同源建模 | 第90-91页 |
| 4.3.2 分子对接 | 第91页 |
| 4.3.3 饱和突变文库的构建 | 第91页 |
| 4.3.4 高通量筛选模型的建立与突变文库的筛选 | 第91-92页 |
| 4.3.5 卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体的表达与分离纯化 | 第92页 |
| 4.3.6 酶活测定 | 第92页 |
| 4.3.7 酶的动力学参数测定 | 第92页 |
| 4.3.8 分析方法 | 第92页 |
| 4.3.9 突变体全细胞催化 1,3-DCP合成手性ECH | 第92页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第92-103页 |
| 4.4.1 卤醇脱卤酶同源建模 | 第92-94页 |
| 4.4.2 卤醇脱卤酶突变位点的选择 | 第94-96页 |
| 4.4.2.1 Hhe C立体选择性突变位点的选择 | 第94-96页 |
| 4.4.3 突变文库的构建及筛选 | 第96-97页 |
| 4.4.4 卤醇脱卤酶及其突变体的分离纯化 | 第97-99页 |
| 4.4.5 动力学参数的测定 | 第99-100页 |
| 4.4.6 分子模拟对接研究 | 第100-103页 |
| 4.4.7 突变体催化 1,3-DCP不对称脱卤 | 第103页 |
| 4.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 第五章 环氧化物水解酶立体选择性及活性的分子改造研究 | 第105-120页 |
| 5.1 引言 | 第105页 |
| 5.2 材料 | 第105-106页 |
| 5.2.1 菌株与质粒 | 第105页 |
| 5.2.2 酶与试剂 | 第105-106页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第106页 |
| 5.2.4 引物 | 第106页 |
| 5.3 方法 | 第106-108页 |
| 5.3.1 同源建模 | 第106-107页 |
| 5.3.2 分子对接 | 第107页 |
| 5.3.3 饱和突变文库的构建 | 第107页 |
| 5.3.4 高通量筛选模型的建立与突变文库的筛选 | 第107-108页 |
| 5.3.5 AmEH及其突变体的表达与分离纯化 | 第108页 |
| 5.3.6 酶活测定 | 第108页 |
| 5.3.7 分析方法 | 第108页 |
| 5.3.8 酶动力学参数测定 | 第108页 |
| 5.3.9 全细胞催化拆分ECH | 第108页 |
| 5.4 结果与分析 | 第108-118页 |
| 5.4.1 环氧化物水解酶同源建模与结构分析 | 第108-109页 |
| 5.4.2 分子对接与突变位点的选择 | 第109-111页 |
| 5.4.3 突变文库的构建与筛选 | 第111-112页 |
| 5.4.4 环氧化物水解酶和突变体的纯化 | 第112-114页 |
| 5.4.5 动力学参数的测定 | 第114页 |
| 5.4.6 分子模拟对接研究 | 第114-116页 |
| 5.4.7 突变体拆分外消旋ECH | 第116-118页 |
| 5.5 本章小结 | 第118-120页 |
| 第六章 双酶体系的构建 | 第120-132页 |
| 6.1 引言 | 第120页 |
| 6.2 实验材料 | 第120-121页 |
| 6.2.1 菌株与质粒 | 第120-121页 |
| 6.2.2 酶与试剂 | 第121页 |
| 6.2.3 主要设备及仪器 | 第121页 |
| 6.2.4 引物 | 第121页 |
| 6.3 实验方法 | 第121-124页 |
| 6.3.1 共表达质粒的构建 | 第121-123页 |
| 6.3.2 定点突变方法 | 第123-124页 |
| 6.3.3 重组菌的培养 | 第124页 |
| 6.3.4 重组菌催化 1,3-DCP合成手性ECH | 第124页 |
| 6.3.5 卤醇脱卤酶的固定化 | 第124页 |
| 6.3.6 环氧化物水解酶的固定化 | 第124页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第124-130页 |
| 6.4.1 基因串联共表达系统的构建 | 第124-126页 |
| 6.4.2 双质粒共表达系统的构建 | 第126页 |
| 6.4.3 双酶体系催化 1,3-DCP合成手性ECH | 第126-129页 |
| 6.4.4 固定化酶偶联催化合成手性ECH | 第129-130页 |
| 6.5 本章小结 | 第130-132页 |
| 第七章 结论与展望 | 第132-134页 |
| 7.1 结论 | 第132-133页 |
| 7.2 展望 | 第133-134页 |
| 参考文献 | 第134-147页 |
| 攻博博士期间发表论文与专利 | 第147-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
